ما الذي يجب مراعاته عند سحب مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

لنجاح تفاعلات التضخيم، من الضروري وجود مكونات التفاعل بالتركيز الصحيح في كل مستحضر. بالإضافة إلى ذلك، من المهم عدم حدوث أي تلوث.

خاصةً عند الحاجة إلى إعداد العديد من التفاعلات، فقد رُسِمَ تحضير ما يُسمى بالمزيج الرئيسي بدلاً من ضخ كل كاشف على حدة في كل وعاء. تتوفر خلطات مُعَدَّة مسبقًا تجاريًا، حيث تُضاف فقط المكونات الخاصة بالعينة (البادئ) والماء. كبديل، يُمكن تحضير الخليط الرئيسي بنفسك. في كلا النوعين، يُوزَّع الخليط على كل وعاء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بدون قالب، وتُضاف عينة الحمض النووي (DNA) بشكل منفصل في النهاية.

لاستخدام مزيج رئيسي مزايا عديدة: أولاً، تقليل عدد خطوات السحب المفردة. بهذه الطريقة، يتم تقليل مخاطر أخطاء المستخدم أثناء السحب وخطر التلوث، وبالطبع توفير الوقت. من حيث المبدأ، تكون دقة السحب أعلى أيضًا نظرًا لتوزيع كميات أكبر. يسهل فهم ذلك عند التحقق من البيانات الفنية للماصات: كلما قل حجم الجرعة، زادت الانحرافات. إن استخدام جميع المستحضرات من نفس الوعاء له تأثير إيجابي على التجانس (في حال خلطها جيدًا). ​​وهذا يُحسّن أيضًا من إمكانية تكرار التجارب.

عند تحضير الخليط الرئيسي، يجب إضافة ما لا يقل عن 10% من الحجم الإضافي (على سبيل المثال، إذا لزم الأمر 10 تحضيرات، فاحسب على أساس 11)، حتى يمتلئ آخر وعاء بشكل صحيح. بهذه الطريقة، يمكن تعويض أخطاء القياس الطفيفة، وتأثير فقدان العينة عند تحديد جرعات المحاليل المحتوية على المنظفات. توجد المنظفات في محاليل إنزيمية مثل البوليميرازات والخلائط الرئيسية، مما يتسبب في تكوين رغوة وبقايا على السطح الداخلي للوعاء الطبيعي.أطراف الماصة.

بناءً على نوع السائل المراد توزيعه، يجب اختيار تقنية الماصة الصحيحة (1) والمعدات المناسبة. بالنسبة للمحاليل التي تحتوي على منظفات، يُنصح باستخدام نظام إزاحة مباشر أو ما يُسمى برؤوس الماصات "منخفضة الاحتفاظ" كبديل للماصات ذات الوسادة الهوائية. تأثيرطرف ماصة ACEيعتمد على سطح كاره للماء بشكل خاص. السوائل التي تحتوي على منظفات لا تترك طبقة دهنية على السطح الداخلي والخارجي، مما يقلل من فقدان المحلول.

إلى جانب دقة تحديد جرعات جميع المكونات، من المهم أيضًا ضمان عدم تلوث المستحضرات. لا يكفي استخدام مواد استهلاكية عالية النقاء، لأن عملية التقطير في ماصة الوسادة الهوائية قد تُنتج رذاذًا يبقى في الماصة. قد ينتقل الحمض النووي (DNA) الموجود في الرذاذ من عينة إلى أخرى في خطوة التقطير التالية، مما يؤدي إلى التلوث. قد تُقلل أنظمة الإزاحة المباشرة المذكورة أعلاه من هذا الخطر أيضًا. بالنسبة للماصات ذات الوسادة الهوائية، من المنطقي استخدام أطراف مرشحة لحماية مخروط الماصة من خلال الاحتفاظ بالرذاذ والرذاذ والجزيئات الحيوية.