Estrazzjoni tal-Aċidu Nuklejku u l-Metodu taż-Żibeġ Manjetiċi

Introduzzjoni

X'inhi l-Estrazzjoni tal-Aċidu Nuklejku?

Fl-aktar kliem sempliċi, l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku hija t-tneħħija tal-RNA u/jew tad-DNA minn kampjun u l-eċċess kollu li mhux meħtieġ. Il-proċess ta' estrazzjoni jiżola l-aċidi nuklejċi minn kampjun u jagħtihom fil-forma ta' eluat ikkonċentrat, ħieles minn dilwenti u kontaminanti li jistgħu jaffettwaw kwalunkwe applikazzjoni downstream.

Applikazzjonijiet tal-Estrazzjoni tal-Aċidu Nuklejku

L-aċidi nuklejċi purifikati jintużaw f'għadd kbir ta' applikazzjonijiet differenti, li jvarjaw f'diversi industriji differenti. Il-kura tas-saħħa hija forsi l-qasam fejn tintuża l-aktar, bl-RNA u d-DNA purifikati meħtieġa għal għadd ta' skopijiet ta' ttestjar differenti.

L-applikazzjonijiet tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku fil-kura tas-saħħa jinkludu:

- Amplifikazzjoni tal-PCR u l-qPCR

- Sekwenzar tal-Ġenerazzjoni li Jmiss (NGS)

- Ġenotipazzjoni tal-SNP ibbażata fuq l-amplifikazzjoni

- Ġenotipazzjoni bbażata fuq array

- Diġestjoni bl-Enżimi ta' Restrizzjoni

- Analiżi bl-użu ta' Enżimi Modifikanti (eż. Ligazzjoni u Klonazzjoni)

Hemm ukoll oqsma oħra lil hinn mill-kura tas-saħħa fejn tintuża l-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku, inklużi iżda mhux limitati għal testijiet tal-paternità, forensika u ġenomika.

Storja qasira tal-Estrazzjoni tal-Aċidu Nuklejku

Estrazzjoni tad-DNADan imur lura żmien twil, bl-ewwel iżolament magħruf ikun sar minn tabib Żvizzeru jismu Friedrich Miescher fl-1869. Miescher kien qed jittama li jsolvi l-prinċipji fundamentali tal-ħajja billi jiddetermina l-kompożizzjoni kimika taċ-ċelloli. Wara li falla bil-limfoċiti, irnexxielu jikseb preċipitat mhux raffinat ta’ DNA minn lewkoċiti misjuba fil-pus fuq faxex mormija. Huwa għamel dan billi żied aċidu u mbagħad alkali maċ-ċellula biex titlaq miċ-ċitoplasma taċ-ċellula, u mbagħad żviluppa protokoll biex jissepara d-DNA mill-proteini l-oħra.

Wara r-riċerka rivoluzzjonarja ta' Miescher, ħafna xjentisti oħra komplew javvanzaw u jiżviluppaw tekniki biex jiżolaw u jippurifikaw id-DNA. Edwin Joseph Cohn, xjentist tal-proteini żviluppa ħafna tekniki għall-purifikazzjoni tal-proteini matul it-Tieni Gwerra Dinjija. Huwa kien responsabbli għall-iżolament tal-frazzjoni tal-albumina tas-serum tal-plażma tad-demm, li hija importanti biex tinżamm il-pressjoni osmotika fil-vini tad-demm. Dan kien kruċjali biex is-suldati jinżammu ħajjin.

Fl-1953 Francis Crick, flimkien ma' Rosalind Franklin u James Watson, iddeterminaw l-istruttura tad-DNA, u wrew li kienet magħmula minn żewġ linji ta' ktajjen twal ta' nukleotidi tal-aċidu nuklejku. Din l-iskoperta rivoluzzjonarja wittiet it-triq għal Meselson u Stahl, li setgħu jiżviluppaw protokoll ta' ċentrifugazzjoni b'gradjent ta' densità biex jiżolaw id-DNA mill-batterja E. Coli hekk kif urew ir-replikazzjoni semi-konservattiva tad-DNA matul l-esperiment tagħhom tal-1958.

Tekniki ta' Estrazzjoni ta' Aċidu Nuklejku

X'inhuma l-4 stadji tal-estrazzjoni tad-DNA?
Il-metodi kollha ta' estrazzjoni jinżlu għall-istess passi fundamentali.

Tfixkil taċ-ĊelluliDan l-istadju, magħruf ukoll bħala lisi taċ-ċelluli, jinvolvi t-tkissir tal-ħajt taċ-ċelluli u/jew tal-membrana taċ-ċelluli, sabiex jiġu rilaxxati l-fluwidi intraċellulari li fihom l-aċidi nuklejċi ta' interess.

Tneħħija ta' Debris Mhux Mixtieq. Dan jinkludi lipidi tal-membrana, proteini u aċidi nuklejċi oħra mhux mixtieqa li jistgħu jinterferixxu mal-applikazzjonijiet downstream.

Iżolament. Hemm numru ta' modi differenti biex tiżola l-aċidi nuklejċi ta' interess mil-liżat imnaddaf li ħloqt, li jaqgħu bejn żewġ kategoriji ewlenin: ibbażat fuq soluzzjoni jew stat solidu (ara t-taqsima li jmiss).

Konċentrazzjoni. Wara li l-aċidi nuklejċi jkunu ġew iżolati mill-kontaminanti u d-dilwenti l-oħra kollha, dawn jiġu ppreżentati f'eluat b'konċentrazzjoni għolja.

Iż-Żewġ Tipi ta' Estrazzjoni
Hemm żewġ tipi ta' estrazzjoni ta' aċidu nuklejku – metodi bbażati fuq soluzzjoni u metodi ta' stat solidu. Il-metodu bbażat fuq soluzzjoni huwa magħruf ukoll bħala l-metodu ta' estrazzjoni kimika, peress li jinvolvi l-użu ta' kimiċi biex tkisser iċ-ċellula u taċċessa l-materjal nuklejku. Dan jista' jkun bl-użu ta' komposti organiċi bħal fenol u kloroform, jew il-komposti inorganiċi inqas ta' ħsara u għalhekk aktar rakkomandati bħal Proteinase K jew ġel tas-silika.

Eżempji ta' metodi differenti ta' estrazzjoni kimika biex titkisser ċellula jinkludu:

- Ksur osmotiku tal-membrana

- Diġestjoni enżimatika tal-ħajt taċ-ċellula

- Solubilizzazzjoni tal-membrana

- Bid-deterġenti

- Bit-trattament bl-alkali

Tekniki ta' stat solidu, magħrufa wkoll bħala metodi mekkaniċi, jinvolvu l-isfruttament ta' kif id-DNA jinteraġixxi ma' sottostrat solidu. Billi tagħżel żibġa jew molekula li d-DNA torbot magħha iżda l-analit le, huwa possibbli li t-tnejn jiġu separati. Eżempji ta' tekniki ta' estrazzjoni f'fażi solida jinkludu l-użu ta' silika u żibġiet manjetiċi.

Estrazzjoni ta' Żibeġ Manjetiċi Spjegata

Il-Metodu ta' Estrazzjoni taż-Żibeġ Manjetiċi
Il-potenzjal għall-estrazzjoni bl-użu ta' żibeġ manjetiċi ġie rikonoxxut għall-ewwel darba fi privattiva tal-Istati Uniti ppreżentata minn Trevor Hawkins, għall-istituzzjoni ta' riċerka tal-Whitehead Institute. Din il-privattiva rrikonoxxiet li kien possibbli li jiġi estratt materjal ġenetiku billi jintrabtu ma' trasportatur ta' appoġġ solidu, li jista' jkun żibeġ manjetiku. Il-prinċipju huwa li tuża żibeġ manjetiku funzjonalizzat ħafna li fuqu jintrabtu l-materjal ġenetiku, li mbagħad jista' jiġi separat mis-supernatant billi tiġi applikata forza manjetika fuq barra tal-kontenitur li jżomm il-kampjun.

Għaliex Tuża l-Estrazzjoni taż-Żibeġ Manjetiċi?
It-teknoloġija tal-estrazzjoni tal-perli manjetiċi qed issir dejjem aktar prevalenti, minħabba l-potenzjal li għandha għal proċeduri ta' estrazzjoni rapidi u effiċjenti. Fi żminijiet riċenti kien hemm żviluppi ta' perli manjetiċi funzjonalizzati ħafna b'sistemi ta' buffer xierqa, li għamlu possibbli l-awtomazzjoni tal-estrazzjoni tal-aċidu nuklejku u fluss tax-xogħol li juża ħafna riżorsi u huwa kosteffiċjenti. Barra minn hekk, il-metodi ta' estrazzjoni tal-perli manjetiċi ma jinvolvux il-passi ta' ċentrifugazzjoni li jistgħu jikkawżaw forzi ta' shear li jkissru biċċiet itwal ta' DNA. Dan ifisser li linji itwal ta' DNA jibqgħu intatti, li huwa importanti fl-ittestjar tal-ġenomika.