Uvod
Kaj je ekstrakcija nukleinskih kislin?
Najpreprosteje povedano, ekstrakcija nukleinskih kislin je odstranitev RNK in/ali DNK iz vzorca in vsega nepotrebnega presežka. Postopek ekstrakcije izolira nukleinske kisline iz vzorca in jih da v obliki koncentriranega eluata, brez razredčil in onesnaževalcev, ki bi lahko vplivali na morebitne nadaljnje aplikacije.
Uporaba ekstrakcije nukleinskih kislin
Prečiščene nukleinske kisline se uporabljajo v številnih različnih aplikacijah, v številnih različnih panogah. Zdravstvo je morda področje, kjer se uporabljajo največ, saj sta prečiščena RNK in DNK potrebna za številne različne testne namene.
Uporaba ekstrakcije nukleinskih kislin v zdravstvu vključuje:
- Sekvenciranje naslednje generacije (NGS)
- Genotipizacija SNP na osnovi amplifikacije
- Genotipizacija na osnovi matrike
- Prebava z restrikcijskimi encimi
- Analize z uporabo modificirajočih encimov (npr. ligacija in kloniranje)
Poleg zdravstva obstajajo tudi druga področja, kjer se uporablja ekstrakcija nukleinskih kislin, vključno z, vendar ne omejeno na, testiranje očetovstva, forenziko in genomiko.
Kratka zgodovina ekstrakcije nukleinskih kislin
Ekstrakcija DNKsega daleč nazaj, saj je prvo znano izolacijo izvedel švicarski zdravnik Friedrich Miescher leta 1869. Miescher je upal, da bo z določitvijo kemične sestave celic rešil temeljna načela življenja. Potem ko mu z limfociti ni uspelo, mu je uspelo pridobiti surovo oborino DNK iz levkocitov, ki so jih našli v gnoju na zavrženih povojih. To je storil tako, da je celici dodal kislino in nato alkalije, da je zapustil celično citoplazmo, nato pa je razvil protokol za ločevanje DNK od drugih beljakovin.
Po Miescherjevi prelomni raziskavi so mnogi drugi znanstveniki nadaljevali z razvojem tehnik za izolacijo in čiščenje DNK. Edwin Joseph Cohn, znanstvenik za beljakovine, je med drugo svetovno vojno razvil številne tehnike za čiščenje beljakovin. Bil je odgovoren za izolacijo frakcije serumskega albumina v krvni plazmi, ki je pomembna za vzdrževanje osmotskega tlaka v krvnih žilah. To je bilo ključnega pomena za ohranjanje življenja vojakov.
Leta 1953 je Francis Crick skupaj z Rosalind Franklin in Jamesom Watsonom določil strukturo DNK in pokazal, da je sestavljena iz dveh nizov dolgih verig nukleinskih kislin in nukleotidov. To prelomno odkritje je utrlo pot Meselsonu in Stahlu, ki sta razvila protokol centrifugiranja z gradientom gostote za izolacijo DNK iz bakterije E. coli, saj sta med svojim poskusom leta 1958 dokazala polkonzervativno replikacijo DNK.
Tehnike ekstrakcije nukleinskih kislin
Katere so 4 faze ekstrakcije DNK?
Vse metode ekstrakcije se zreducirajo na iste temeljne korake.
Motnje celicTa faza, znana tudi kot celična liza, vključuje razgradnjo celične stene in/ali celične membrane, da se sprostijo znotrajcelične tekočine, ki vsebujejo nukleinske kisline, ki nas zanimajo.
Odstranjevanje neželenih ostankov. To vključuje membranske lipide, beljakovine in druge neželene nukleinske kisline, ki lahko motijo nadaljnje aplikacije.
Izolacija. Obstaja več različnih načinov za izolacijo nukleinskih kislin, ki nas zanimajo, iz prečiščenega lizata, ki ste ga ustvarili, ki spadajo v dve glavni kategoriji: na osnovi raztopine ali v trdnem stanju (glejte naslednji razdelek).
Koncentriranje. Ko so nukleinske kisline izolirane od vseh drugih onesnaževalcev in razredčil, so predstavljene v visoko koncentriranem eluatu.
Dve vrsti ekstrakcije
Obstajata dve vrsti ekstrakcije nukleinskih kislin – metode na osnovi raztopine in metode v trdnem stanju. Metoda na osnovi raztopine je znana tudi kot metoda kemične ekstrakcije, saj vključuje uporabo kemikalij za razgradnjo celice in dostop do nukleinskega materiala. To lahko storimo z uporabo organskih spojin, kot sta fenol in kloroform, ali manj škodljivih in zato bolj priporočljivih anorganskih spojin, kot sta proteinaza K ali silikagel.
Primeri različnih metod kemične ekstrakcije za razgradnjo celice vključujejo:
- Osmotska ruptura membrane
- Encimska prebava celične stene
- Solubilizacija membrane
- Z detergenti
- Z alkalno obdelavo
Tehnike trdne faze, znane tudi kot mehanske metode, vključujejo izkoriščanje interakcije DNK s trdnim substratom. Z izbiro kroglice ali molekule, na katero se bo vezala DNK, analit pa ne, je mogoče obe snovi ločiti. Primeri tehnik ekstrakcije v trdni fazi vključujejo uporabo silicijevega dioksida in magnetnih kroglic.
Pojasnjena ekstrakcija magnetnih kroglic
Metoda ekstrakcije magnetnih kroglic
Potencial za ekstrakcijo z magnetnimi kroglicami je bil prvič prepoznan v ameriškem patentu, ki ga je vložil Trevor Hawkins za raziskovalno ustanovo Whitehead Institute. Ta patent je potrdil, da je mogoče ekstrahirati genski material z vezavo na trdni nosilec, ki je lahko magnetna kroglica. Načelo je, da se uporabi visoko funkcionalizirana magnetna kroglica, na katero se veže genski material, ki ga je nato mogoče ločiti od supernatanta z magnetno silo na zunanjo stran posode, ki vsebuje vzorec.
Zakaj uporabljati ekstrakcijo magnetnih kroglic?
Tehnologija ekstrakcije z magnetnimi kroglicami postaja vse bolj razširjena zaradi potenciala, ki ga ponuja za hitre in učinkovite postopke ekstrakcije. V zadnjem času so bile razvite visoko funkcionalizirane magnetne kroglice z ustreznimi puferskimi sistemi, ki so omogočile avtomatizacijo ekstrakcije nukleinskih kislin in potek dela, ki je zelo priročen in stroškovno učinkovit. Poleg tega metode ekstrakcije z magnetnimi kroglicami ne vključujejo korakov centrifugiranja, ki lahko povzročijo strižne sile, ki razgradijo daljše dele DNK. To pomeni, da daljše verige DNK ostanejo nedotaknjene, kar je pomembno pri genomskem testiranju.
Čas objave: 25. november 2022