Úvod
Čo je extrakcia nukleových kyselín?
Najjednoduchšie povedané, extrakcia nukleových kyselín je odstránenie RNA a/alebo DNA zo vzorky a všetkého nepotrebného prebytku. Proces extrakcie izoluje nukleové kyseliny zo vzorky a poskytuje ich vo forme koncentrovaného eluátu, bez riedidiel a kontaminantov, ktoré by mohli ovplyvniť akékoľvek následné aplikácie.
Aplikácie extrakcie nukleových kyselín
Purifikované nukleové kyseliny sa používajú v množstve rôznych aplikácií v rôznych odvetviach. Zdravotníctvo je pravdepodobne oblasťou, kde sa používajú najviac, pričom purifikovaná RNA a DNA sú potrebné na množstvo rôznych testovacích účelov.
Medzi aplikácie extrakcie nukleových kyselín v zdravotníctve patria:
- Sekvenovanie novej generácie (NGS)
- Genotypizácia SNP založená na amplifikácii
- Genotypizácia založená na čipoch
- Trávenie reštrikčnými enzýmami
- Analýzy s použitím modifikujúcich enzýmov (napr. ligácia a klonovanie)
Existujú aj iné oblasti okrem zdravotníctva, kde sa používa extrakcia nukleových kyselín, vrátane, ale nie výlučne, testovania otcovstva, forenznej vedy a genomiky.
Stručná história extrakcie nukleových kyselín
Extrakcia DNAsiaha ďaleko do minulosti, pričom prvú známu izoláciu vykonal švajčiarsky lekár Friedrich Miescher v roku 1869. Miescher dúfal, že vyrieši základné princípy života určením chemického zloženia buniek. Po neúspechu s lymfocytmi sa mu podarilo získať surovú zrazeninu DNA z leukocytov nachádzajúcich sa v hnise na vyhodených obväzoch. Urobil to pridaním kyseliny a potom zásady do bunky, aby opustil cytoplazmu bunky, a potom vyvinul protokol na oddelenie DNA od ostatných proteínov.
Po Miescherovom prelomovom výskume mnoho ďalších vedcov pokračovalo v rozvíjaní techník izolácie a čistenia DNA. Edwin Joseph Cohn, vedec zaoberajúci sa bielkovinami, vyvinul počas druhej svetovej vojny mnoho techník na čistenie bielkovín. Bol zodpovedný za izoláciu frakcie sérového albumínu z krvnej plazmy, ktorá je dôležitá pre udržiavanie osmotického tlaku v cievach. To bolo kľúčové pre udržanie vojakov nažive.
V roku 1953 Francis Crick spolu s Rosalind Franklinovou a Jamesom Watsonom určili štruktúru DNA a ukázali, že sa skladá z dvoch vlákien dlhých reťazcov nukleových kyselín a nukleotidov. Tento prelomový objav vydláždil cestu Meselsonovi a Stahlovi, ktorí dokázali vyvinúť protokol centrifugácie v gradiente hustoty na izoláciu DNA z baktérií E. coli, keď počas svojho experimentu v roku 1958 demonštrovali semikonzervatívnu replikáciu DNA.
Techniky extrakcie nukleových kyselín
Aké sú 4 fázy extrakcie DNA?
Všetky metódy extrakcie sa zredukujú na rovnaké základné kroky.
Narušenie buniekTáto fáza, známa aj ako lýza buniek, zahŕňa rozbitie bunkovej steny a/alebo bunkovej membrány, aby sa uvoľnili intracelulárne tekutiny obsahujúce sledované nukleové kyseliny.
Odstraňovanie nežiaducich nečistôt. Patria sem membránové lipidy, proteíny a iné nežiaduce nukleové kyseliny, ktoré môžu interferovať s následnými aplikáciami.
Izolácia. Existuje niekoľko rôznych spôsobov, ako izolovať požadované nukleové kyseliny z vytvoreného vyčisteného lyzátu, ktoré spadajú do dvoch hlavných kategórií: na báze roztoku alebo v pevnom stave (pozri ďalšiu časť).
Koncentrácia. Po izolácii nukleových kyselín od všetkých ostatných kontaminantov a riedidiel sa tieto prezentujú vo vysoko koncentrovanom eluáte.
Dva typy extrakcie
Existujú dva typy extrakcie nukleových kyselín – metódy založené na roztoku a metódy v tuhom skupenstve. Metóda založená na roztoku je tiež známa ako metóda chemickej extrakcie, pretože zahŕňa použitie chemikálií na rozloženie bunky a prístup k nukleovému materiálu. Môže sa použiť buď organické zlúčeniny, ako je fenol a chloroform, alebo menej škodlivé a preto odporúčanejšie anorganické zlúčeniny, ako je proteináza K alebo silikagél.
Medzi príklady rôznych metód chemickej extrakcie na rozloženie bunky patria:
- Osmotické pretrhnutie membrány
- Enzymatické štiepenie bunkovej steny
- Solubilizácia membrány
- S čistiacimi prostriedkami
- S alkalickou úpravou
Techniky tuhého skupenstva, známe aj ako mechanické metódy, zahŕňajú využitie toho, ako DNA interaguje s tuhým substrátom. Výberom guľôčky alebo molekuly, na ktorú sa DNA naviaže, ale analyt nie, je možné tieto dve látky oddeliť. Medzi príklady techník extrakcie v tuhej fáze patrí použitie oxidu kremičitého a magnetických guľôčok.
Vysvetlenie extrakcie magnetických guľôčok
Metóda extrakcie magnetických guľôčok
Potenciál extrakcie pomocou magnetických guľôčok bol prvýkrát rozpoznaný v americkom patente, ktorý podal Trevor Hawkins pre výskumnú inštitúciu Whitehead Institute. Tento patent uznal, že je možné extrahovať genetický materiál jeho naviazaním na pevný nosič, ktorým môže byť magnetická guľôčka. Princíp spočíva v použití vysoko funkcionalizovanej magnetickej guľôčky, na ktorú sa genetický materiál naviaže, a ktorú je potom možné oddeliť od supernatantu pôsobením magnetickej sily na vonkajšiu stranu nádoby, v ktorej sa nachádza vzorka.
Prečo používať extrakciu magnetickými guľôčkami?
Technológia extrakcie magnetickými guľôčkami sa stáva čoraz rozšírenejšou vďaka potenciálu, ktorý má pre rýchle a efektívne extrakčné postupy. V poslednej dobe došlo k vývoju vysoko funkcionalizovaných magnetických guľôčok s vhodnými pufrovacími systémami, ktoré umožnili automatizáciu extrakcie nukleových kyselín a pracovný postup, ktorý je veľmi nenáročný na zdroje a nákladovo efektívny. Metódy extrakcie magnetickými guľôčkami tiež nezahŕňajú kroky centrifugácie, ktoré môžu spôsobiť šmykové sily, ktoré rozbíjajú dlhšie časti DNA. To znamená, že dlhšie vlákna DNA zostávajú neporušené, čo je dôležité pri genomickom testovaní.
Čas uverejnenia: 25. novembra 2022