Nukleinsyreekstraksjon og magnetisk kulemetode

Introduksjon

Hva er nukleinsyreekstraksjon?

Enkelt sagt er nukleinsyreekstraksjon fjerning av RNA og/eller DNA fra en prøve og alt overflødig DNA. Ekstraksjonsprosessen isolerer nukleinsyrene fra en prøve og gir dem i form av et konsentrert eluat, fritt for fortynningsmidler og forurensninger som kan påvirke eventuelle nedstrømsapplikasjoner.

Anvendelser av nukleinsyreekstraksjon

Rensede nukleinsyrer brukes i en rekke forskjellige bruksområder, på tvers av en rekke forskjellige bransjer. Helsevesenet er kanskje det området der det brukes mest, med renset RNA og DNA som kreves for en rekke forskjellige testformål.

Anvendelser av nukleinsyreekstraksjon i helsevesenet inkluderer:

- PCR- og qPCR-amplifikasjon

- Neste generasjons sekvensering (NGS)

- Amplifikasjonsbasert SNP-genotyping

- Array-basert genotyping

- Fordøyelse av restriksjonsenzym

- Analyser ved bruk av modifiserende enzymer (f.eks. ligering og kloning)

Det finnes også andre felt utover helsevesenet der nukleinsyreekstraksjon brukes, inkludert, men ikke begrenset til, farskapstesting, rettsmedisin og genomikk.

En kort historie om nukleinsyreutvinning

DNA-ekstraksjondateres langt tilbake i tid, og den første kjente isolasjonen ble utført av en sveitsisk lege ved navn Friedrich Miescher i 1869. Miescher håpet å løse livets grunnleggende prinsipper ved å bestemme den kjemiske sammensetningen av celler. Etter å ha mislyktes med lymfocytter, klarte han å utvinne et rått DNA-utfelling fra leukocytter funnet i puss på kasserte bandasjer. Han gjorde dette ved å tilsette syre og deretter alkali til cellen for å forlate cellens cytoplasma, og utviklet deretter en protokoll for å separere DNA-et fra de andre proteinene.

Etter Mieschers banebrytende forskning har mange andre forskere gått videre og utviklet teknikker for å isolere og rense DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforsker, utviklet mange teknikker for proteinrensing under andre verdenskrig. Han var ansvarlig for å isolere serumalbuminfraksjonen av blodplasma, som er viktig for å opprettholde det osmotiske trykket i blodårene. Dette var avgjørende for å holde soldater i live.

I 1953 bestemte Francis Crick, sammen med Rosalind Franklin og James Watson, strukturen til DNA, og viste at det var bygd opp av to tråder med lange kjeder av nukleinsyrenukleotider. Denne banebrytende oppdagelsen banet vei for Meselson og Stahl, som var i stand til å utvikle en tetthetsgradientsentrifugeringsprotokoll for å isolere DNA fra E. coli-bakterier, da de demonstrerte semikonservativ replikasjon av DNA under eksperimentet sitt i 1958.

Teknikker for nukleinsyreekstraksjon

Hva er de fire stadiene i DNA-ekstraksjon?
Alle ekstraksjonsmetoder koker ned til de samme grunnleggende trinnene.

CelleforstyrrelseDenne fasen, også kjent som cellelyse, innebærer å bryte ned celleveggen og/eller cellemembranen for å frigjøre de intracellulære væskene som inneholder de aktuelle nukleinsyrene.

Fjerning av uønsket avfall. Dette inkluderer membranlipider, proteiner og andre uønskede nukleinsyrer som kan forstyrre nedstrøms applikasjoner.

Isolering. Det finnes en rekke forskjellige måter å isolere nukleinsyrene av interesse fra det klarerte lysatet du har laget, som faller innenfor to hovedkategorier: løsningsbasert eller fast tilstand (se neste avsnitt).

Konsentrasjon. Etter at nukleinsyrene er isolert fra alle andre forurensninger og fortynningsmidler, presenteres de i et høykonsentrert eluat.

De to typene ekstraksjon
Det finnes to typer nukleinsyreekstraksjon – løsningsbaserte metoder og faststoffmetoder. Den løsningsbaserte metoden er også kjent som kjemisk ekstraksjonsmetoden, ettersom den innebærer bruk av kjemikalier for å bryte ned cellen og få tilgang til nukleinmaterialet. Dette kan enten være bruk av organiske forbindelser som fenol og kloroform, eller de mindre skadelige og derfor mer anbefalte uorganiske forbindelsene som proteinase K eller silikagel.

Eksempler på ulike kjemiske ekstraksjonsmetoder for å bryte ned en celle inkluderer:

- Osmotisk ruptur av membranen

- Enzymatisk fordøyelse av celleveggen

- Løselighet av membran

- Med vaskemidler

- Med alkalibehandling

Fastfaseteknikker, også kjent som mekaniske metoder, innebærer å utnytte hvordan DNA samhandler med et fast substrat. Ved å velge en kule eller et molekyl som DNA-et vil binde seg til, men analytten ikke vil, er det mulig å skille de to. Eksempler på fastfaseekstraksjonsteknikker inkluderer bruk av silika og magnetiske kuler.

Magnetisk perleutvinning forklart

Den magnetiske kuleekstraksjonsmetoden
Potensialet for ekstraksjon ved hjelp av magnetiske kuler ble først anerkjent i et amerikansk patent innlevert av Trevor Hawkins, for forskningsinstitusjonen Whitehead Institute. Dette patentet anerkjente at det var mulig å ekstrahere genetisk materiale ved å binde det til en fast bærer, som kan være en magnetisk kule. Prinsippet er at man bruker en svært funksjonalisert magnetisk kule som det genetiske materialet vil binde seg til, som deretter kan skilles fra supernatanten ved å påføre en magnetisk kraft på utsiden av beholderen som inneholder prøven.

Hvorfor bruke magnetisk kuleutvinning?
Teknologi for ekstraksjon av magnetiske kuler blir stadig mer utbredt på grunn av potensialet den har for raske og effektive ekstraksjonsprosedyrer. I den senere tid har det vært utvikling av svært funksjonaliserte magnetiske kuler med passende buffersystemer, noe som har muliggjort automatisering av nukleinsyreekstraksjon og en arbeidsflyt som er svært ressurslett og kostnadseffektiv. Metoder for ekstraksjon av magnetiske kuler involverer heller ikke sentrifugeringstrinn som kan forårsake skjærkrefter som bryter opp lengre DNA-biter. Dette betyr at lengre DNA-tråder forblir intakte, noe som er viktig i genomisk testing.