Εισαγωγή
Τι είναι η εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος;
Με απλά λόγια, η εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων είναι η αφαίρεση του RNA ή/και του DNA από ένα δείγμα και όλης της περίσσειας που δεν είναι απαραίτητη. Η διαδικασία της εκχύλισης απομονώνει τα νουκλεϊκά οξέα από ένα δείγμα και τα αποδίδει με τη μορφή ενός συμπυκνωμένου εκλούσματος, απαλλαγμένου από αραιωτικά και ρύπους που θα μπορούσαν να επηρεάσουν οποιεσδήποτε εφαρμογές κατάντη.
Εφαρμογές της εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων
Τα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα χρησιμοποιούνται σε πληθώρα διαφορετικών εφαρμογών, που κυμαίνονται σε πολλαπλούς διαφορετικούς κλάδους. Η υγειονομική περίθαλψη είναι ίσως ο τομέας όπου χρησιμοποιούνται περισσότερο, με το καθαρό RNA και DNA να απαιτούνται για μια σειρά από διαφορετικούς σκοπούς δοκιμών.
Οι εφαρμογές της εξαγωγής νουκλεϊκών οξέων στην υγειονομική περίθαλψη περιλαμβάνουν:
- Αλληλούχιση Επόμενης Γενιάς (NGS)
- Γονότυπος SNP με βάση την ενίσχυση
- Γονοτυποποίηση βάσει πίνακα
- Πέψη με περιοριστικά ένζυμα
- Αναλύσεις με χρήση τροποποιητικών ενζύμων (π.χ. σύνδεση και κλωνοποίηση)
Υπάρχουν επίσης και άλλοι τομείς πέρα από την υγειονομική περίθαλψη όπου χρησιμοποιείται η εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, των εξετάσεων πατρότητας, της εγκληματολογίας και της γονιδιωματικής.
Μια σύντομη ιστορία της εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων
Εξαγωγή DNAΧρονολογείται από πολύ παλιά, με την πρώτη γνωστή απομόνωση να πραγματοποιείται από έναν Ελβετό γιατρό ονόματι Friedrich Miescher το 1869. Ο Miescher ήλπιζε να λύσει τις θεμελιώδεις αρχές της ζωής προσδιορίζοντας τη χημική σύνθεση των κυττάρων. Αφού απέτυχε με τα λεμφοκύτταρα, κατάφερε να λάβει ένα ακατέργαστο ίζημα DNA από λευκοκύτταρα που βρέθηκαν σε πύον σε πεταμένους επιδέσμους. Το πέτυχε αυτό προσθέτοντας οξύ και στη συνέχεια αλκάλια στο κύτταρο για να φύγει από το κυτταρόπλασμα του κυττάρου και στη συνέχεια ανέπτυξε ένα πρωτόκολλο για τον διαχωρισμό του DNA από τις άλλες πρωτεΐνες.
Μετά την πρωτοποριακή έρευνα του Miescher, πολλοί άλλοι επιστήμονες προχώρησαν στην ανάπτυξη τεχνικών για την απομόνωση και τον καθαρισμό του DNA. Ο Edwin Joseph Cohn, ένας επιστήμονας πρωτεϊνών, ανέπτυξε πολλές τεχνικές για τον καθαρισμό πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του Β' Παγκοσμίου Πολέμου. Ήταν υπεύθυνος για την απομόνωση του κλάσματος λευκωματίνης ορού του πλάσματος του αίματος, το οποίο είναι σημαντικό για τη διατήρηση της οσμωτικής πίεσης στα αιμοφόρα αγγεία. Αυτό ήταν κρίσιμο για τη διατήρηση της ζωής των στρατιωτών.
Το 1953, ο Φράνσις Κρικ, μαζί με τη Ρόζαλιντ Φράνκλιν και τον Τζέιμς Γουάτσον, προσδιόρισαν τη δομή του DNA, δείχνοντας ότι αποτελείται από δύο κλώνους μακριών αλυσίδων νουκλεοτιδίων νουκλεϊκού οξέος. Αυτή η πρωτοποριακή ανακάλυψη άνοιξε το δρόμο για τους Μέσελσον και Σταλ, οι οποίοι κατάφεραν να αναπτύξουν ένα πρωτόκολλο φυγοκέντρησης βαθμίδωσης πυκνότητας για την απομόνωση DNA από βακτήρια E. Coli, καθώς απέδειξαν την ημι-συντηρητική αντιγραφή του DNA κατά τη διάρκεια του πειράματός τους το 1958.
Τεχνικές εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων
Ποια είναι τα 4 στάδια της εξαγωγής DNA;
Όλες οι μέθοδοι εξαγωγής καταλήγουν στα ίδια βασικά βήματα.
Διαταραχή κυττάρωνΑυτό το στάδιο, γνωστό και ως κυτταρική λύση, περιλαμβάνει τη διάσπαση του κυτταρικού τοιχώματος ή/και της κυτταρικής μεμβράνης, προκειμένου να απελευθερωθούν τα ενδοκυτταρικά υγρά που περιέχουν τα νουκλεϊκά οξέα που μας ενδιαφέρουν.
Απομάκρυνση ανεπιθύμητων υπολειμμάτων. Αυτό περιλαμβάνει λιπίδια μεμβράνης, πρωτεΐνες και άλλα ανεπιθύμητα νουκλεϊκά οξέα που μπορούν να επηρεάσουν τις εφαρμογές κατάντη.
Απομόνωση. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για να απομονώσετε τα νουκλεϊκά οξέα που σας ενδιαφέρουν από το διαυγασμένο λύμα που δημιουργήσατε, οι οποίοι εμπίπτουν σε δύο κύριες κατηγορίες: σε διάλυμα ή σε στερεά κατάσταση (βλ. επόμενη ενότητα).
Συγκέντρωση. Αφού τα νουκλεϊκά οξέα απομονωθούν από όλους τους άλλους ρύπους και αραιωτικά, παρουσιάζονται σε ένα εξαιρετικά συμπυκνωμένο έκλουσμα.
Οι δύο τύποι εξαγωγής
Υπάρχουν δύο τύποι εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων - οι μέθοδοι που βασίζονται σε διάλυμα και οι μέθοδοι στερεάς κατάστασης. Η μέθοδος που βασίζεται σε διάλυμα είναι επίσης γνωστή ως μέθοδος χημικής εκχύλισης, καθώς περιλαμβάνει τη χρήση χημικών ουσιών για τη διάσπαση του κυττάρου και την πρόσβαση στο νουκλεϊκό υλικό. Αυτό μπορεί να γίνεται είτε με τη χρήση οργανικών ενώσεων όπως η φαινόλη και το χλωροφόρμιο, είτε με τις λιγότερο επιβλαβείς και επομένως πιο συνιστώμενες ανόργανες ενώσεις όπως η πρωτεϊνάση Κ ή η σιλικαζέλ.
Παραδείγματα διαφορετικών μεθόδων χημικής εκχύλισης για τη διάσπαση ενός κυττάρου περιλαμβάνουν:
- Οσμωτική ρήξη της μεμβράνης
- Ενζυμική πέψη του κυτταρικού τοιχώματος
- Διαλυτοποίηση της μεμβράνης
- Με απορρυπαντικά
- Με αλκαλική επεξεργασία
Οι τεχνικές στερεάς κατάστασης, γνωστές και ως μηχανικές μέθοδοι, περιλαμβάνουν την αξιοποίηση του τρόπου με τον οποίο το DNA αλληλεπιδρά με ένα στερεό υπόστρωμα. Επιλέγοντας μια χάντρα ή μόριο με την οποία θα συνδεθεί το DNA αλλά όχι ο αναλύτης, είναι δυνατός ο διαχωρισμός των δύο. Παραδείγματα τεχνικών εκχύλισης σε στερεά φάση περιλαμβάνουν τη χρήση πυριτίου και μαγνητικών χαντρών.
Εξήγηση της εξαγωγής μαγνητικών σφαιριδίων
Η μέθοδος εκχύλισης μαγνητικών σφαιριδίων
Η δυνατότητα εξαγωγής με χρήση μαγνητικών σφαιριδίων αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά σε ένα αμερικανικό δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που κατατέθηκε από τον Trevor Hawkins, για το ερευνητικό ίδρυμα του Whitehead Institute. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας αναγνώρισε ότι ήταν δυνατή η εξαγωγή γενετικού υλικού με τη σύνδεσή του σε ένα στερεό φορέα υποστήριξης, το οποίο θα μπορούσε να είναι μια μαγνητική χάντρα. Η αρχή είναι ότι χρησιμοποιείτε μια μαγνητική χάντρα υψηλής λειτουργικοποίησης στην οποία θα συνδεθεί το γενετικό υλικό, η οποία στη συνέχεια μπορεί να διαχωριστεί από το υπερκείμενο υγρό ασκώντας μαγνητική δύναμη στο εξωτερικό του δοχείου που περιέχει το δείγμα.
Γιατί να χρησιμοποιήσετε μαγνητική εξαγωγή σφαιριδίων;
Η τεχνολογία εκχύλισης με μαγνητικά σφαιρίδια γίνεται ολοένα και πιο διαδεδομένη, λόγω των δυνατοτήτων που προσφέρει για γρήγορες και αποτελεσματικές διαδικασίες εκχύλισης. Πρόσφατα, έχουν αναπτυχθεί μαγνητικά σφαιρίδια υψηλής λειτουργικοποίησης με κατάλληλα ρυθμιστικά συστήματα, τα οποία έχουν καταστήσει δυνατή την αυτοματοποίηση της εκχύλισης νουκλεϊκών οξέων και μια ροή εργασίας που είναι πολύ ελαφριά από άποψη πόρων και οικονομικά αποδοτική. Επίσης, οι μέθοδοι εκχύλισης με μαγνητικά σφαιρίδια δεν περιλαμβάνουν τα στάδια φυγοκέντρησης που μπορούν να προκαλέσουν δυνάμεις διάτμησης που διασπούν μεγαλύτερα κομμάτια DNA. Αυτό σημαίνει ότι οι μεγαλύτερες αλυσίδες DNA παραμένουν άθικτες, κάτι που είναι σημαντικό στις γονιδιωματικές δοκιμές.
Ώρα δημοσίευσης: 25 Νοεμβρίου 2022