Indledning
Hvad er nukleinsyreekstraktion?
I den allerenkleste form er nukleinsyreekstraktion fjernelse af RNA og/eller DNA fra en prøve og alt overskydende, der ikke er nødvendigt. Ekstraktionsprocessen isolerer nukleinsyrerne fra en prøve og giver dem i form af et koncentreret eluat, fri for fortyndingsmidler og forurenende stoffer, der kan påvirke eventuelle efterfølgende anvendelser.
Anvendelser af nukleinsyreekstraktion
Rensede nukleinsyrer anvendes i en lang række forskellige anvendelser, der spænder over flere forskellige brancher. Sundhedsvæsenet er måske det område, hvor det anvendes mest, da renset RNA og DNA er nødvendigt til en lang række forskellige testformål.
Anvendelser af nukleinsyreekstraktion i sundhedsvæsenet omfatter:
- Næste generations sekventering (NGS)
- Amplifikationsbaseret SNP-genotypning
- Array-baseret genotypning
- Restriktionsenzymfordøjelse
- Analyser ved hjælp af modificerende enzymer (f.eks. ligering og kloning)
Der er også andre områder ud over sundhedsvæsenet, hvor nukleinsyreekstraktion anvendes, herunder, men ikke begrænset til, faderskabstest, retsmedicin og genomik.
En kort historie om nukleinsyreekstraktion
DNA-ekstraktiongår langt tilbage, hvor den første kendte isolering blev udført af en schweizisk læge ved navn Friedrich Miescher i 1869. Mischer håbede at kunne løse livets grundlæggende principper ved at bestemme cellernes kemiske sammensætning. Efter at have fejlet med lymfocytter, var han i stand til at udvinde et råt bundfald af DNA fra leukocytter fundet i pus på kasserede bandager. Han gjorde dette ved at tilsætte syre og derefter base til cellen for at efterlade cellens cytoplasma, og udviklede derefter en protokol til at adskille DNA'et fra de andre proteiner.
Efter Mieschers banebrydende forskning er mange andre forskere gået videre og har udviklet teknikker til at isolere og oprense DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforsker, udviklede mange teknikker til proteinoprensning under 2. verdenskrig. Han var ansvarlig for at isolere serumalbuminfraktionen af blodplasma, hvilket er vigtigt for at opretholde det osmotiske tryk i blodkarrene. Dette var afgørende for at holde soldater i live.
I 1953 bestemte Francis Crick sammen med Rosalind Franklin og James Watson DNA'ets struktur og viste, at det var opbygget af to strenge af lange kæder af nukleinsyrenukleotider. Denne banebrydende opdagelse banede vejen for Meselson og Stahl, som var i stand til at udvikle en densitetsgradientcentrifugeringsprotokol til at isolere DNA fra E. coli-bakterier, da de demonstrerede den semi-konservative replikation af DNA under deres eksperiment i 1958.
Teknikker til nukleinsyreekstraktion
Hvad er de 4 stadier i DNA-ekstraktion?
Alle ekstraktionsmetoder koger ned til de samme grundlæggende trin.
CelleforstyrrelseDenne fase, også kendt som cellelyse, involverer nedbrydning af cellevæggen og/eller cellemembranen for at frigive de intracellulære væsker, der indeholder de interessante nukleinsyrer.
Fjernelse af uønsket affald. Dette omfatter membranlipider, proteiner og andre uønskede nukleinsyrer, som kan forstyrre efterfølgende applikationer.
Isolering. Der er en række forskellige måder at isolere de interessante nukleinsyrer fra det klarede lysat, du har oprettet, som falder inden for to hovedkategorier: opløsningsbaseret eller faststof (se næste afsnit).
Koncentration. Efter at nukleinsyrerne er blevet isoleret fra alle andre forurenende stoffer og fortyndingsmidler, præsenteres de i et højkoncentreret eluat.
De to typer ekstraktion
Der findes to typer nukleinsyreekstraktion – opløsningsbaserede metoder og faststofmetoder. Den opløsningsbaserede metode er også kendt som den kemiske ekstraktionsmetode, da den involverer brug af kemikalier til at nedbryde cellen og få adgang til nukleinmaterialet. Dette kan enten være ved hjælp af organiske forbindelser såsom phenol og chloroform, eller de mindre skadelige og derfor mere anbefalede uorganiske forbindelser såsom proteinase K eller silicagel.
Eksempler på forskellige kemiske ekstraktionsmetoder til at nedbryde en celle inkluderer:
- Osmotisk membranruptur
- Enzymatisk fordøjelse af cellevæggen
- Opløselighed af membran
- Med vaskemidler
- Med alkalibehandling
Fastfaseteknikker, også kendt som mekaniske metoder, involverer udnyttelse af, hvordan DNA interagerer med et fast substrat. Ved at vælge en perle eller et molekyle, som DNA'et vil binde sig til, men analytten ikke vil, er det muligt at adskille de to. Eksempler på fastfaseekstraktionsteknikker inkluderer brug af silica og magnetiske perler.
Forklaring af magnetisk perleekstraktion
Den magnetiske perleekstraktionsmetod
Potentialet for ekstraktion ved hjælp af magnetiske perler blev først anerkendt i et amerikansk patent indgivet af Trevor Hawkins for forskningsinstitutionen Whitehead Institute. Dette patent anerkendte, at det var muligt at ekstrahere genetisk materiale ved at binde det til en fast bærer, som kunne være en magnetisk perle. Princippet er, at man bruger en højt funktionaliseret magnetisk perle, som det genetiske materiale binder sig til, og som derefter kan adskilles fra supernatanten ved at påføre en magnetisk kraft på ydersiden af beholderen, der indeholder prøven.
Hvorfor bruge magnetisk perleekstraktion?
Magnetisk perleekstraktionsteknologi bliver stadig mere udbredt på grund af det potentiale, den rummer for hurtige og effektive ekstraktionsprocedurer. I den seneste tid er der sket udviklingen af højt funktionaliserede magnetiske perler med passende buffersystemer, hvilket har muliggjort automatisering af nukleinsyreekstraktion og en arbejdsgang, der er meget ressourcebesparende og omkostningseffektiv. Derudover involverer magnetiske perleekstraktionsmetoder ikke centrifugeringstrin, der kan forårsage forskydningskræfter, der opbryder længere DNA-stykker. Det betyder, at længere DNA-strenge forbliver intakte, hvilket er vigtigt i genomisk testning.
Opslagstidspunkt: 25. november 2022