Nukleinsyraextraktion och magnetisk pärlmetoden

Introduktion

Vad är nukleinsyraextraktion?

Enklast uttryckt är nukleinsyraextraktion avlägsnandet av RNA och/eller DNA från ett prov och allt överskott som inte är nödvändigt. Extraktionsprocessen isolerar nukleinsyrorna från ett prov och ger dem i form av ett koncentrerat eluat, fritt från utspädningsmedel och föroreningar som kan påverka eventuella efterföljande tillämpningar.

Tillämpningar av nukleinsyraextraktion

Renade nukleinsyror används i en mängd olika tillämpningar, inom flera olika branscher. Sjukvården är kanske det område där den används mest, med renat RNA och DNA som krävs för en mängd olika teständamål.

Tillämpningar av nukleinsyraextraktion inom sjukvården inkluderar:

- PCR- och qPCR-amplifiering

- Nästa generations sekvensering (NGS)

- Amplifieringsbaserad SNP-genotypning

- Arraybaserad genotypning

- Restriktionsenzymdigerering

- Analyser med modifierande enzymer (t.ex. ligering och kloning)

Det finns också andra områden utöver hälso- och sjukvården där nukleinsyraextraktion används, inklusive men inte begränsat till faderskapstestning, forensik och genomik.

En kort historia om nukleinsyrautvinning

DNA-extraktiongår långt tillbaka, med den första kända isoleringen utförd av en schweizisk läkare vid namn Friedrich Miescher år 1869. Mischer hoppades kunna lösa livets grundläggande principer genom att bestämma cellernas kemiska sammansättning. Efter att ha misslyckats med lymfocyter kunde han erhålla en rå fällning av DNA från leukocyter som fanns i pus på kasserade bandage. Han gjorde detta genom att tillsätta syra och sedan alkali till cellen för att lämna cellens cytoplasma, och utvecklade sedan ett protokoll för att separera DNA:t från de andra proteinerna.

Efter Mieschers banbrytande forskning har många andra forskare gått vidare och utvecklat tekniker för att isolera och rena DNA. Edwin Joseph Cohn, en proteinforskare, utvecklade många tekniker för proteinrening under andra världskriget. Han var ansvarig för att isolera serumalbuminfraktionen i blodplasma, vilket är viktigt för att upprätthålla det osmotiska trycket i blodkärlen. Detta var avgörande för att hålla soldater vid liv.

År 1953 bestämde Francis Crick, tillsammans med Rosalind Franklin och James Watson, DNA:ts struktur och visade att det bestod av två strängar av långa kedjor av nukleinsyranukleotider. Denna banbrytande upptäckt banade väg för Meselson och Stahl, som kunde utveckla ett densitetsgradientcentrifugeringsprotokoll för att isolera DNA från E. coli-bakterier, då de demonstrerade den semikonservativa replikeringen av DNA under sitt experiment 1958.

Tekniker för nukleinsyraextraktion

Vilka är de fyra stegen i DNA-extraktion?
Alla extraktionsmetoder kokar ner till samma grundläggande steg.

CellstörningDetta steg, även känt som cellys, innebär att cellväggen och/eller cellmembranet bryts ner för att frigöra de intracellulära vätskor som innehåller de aktuella nukleinsyrorna.

Borttagning av oönskat skräp. Detta inkluderar membranlipider, proteiner och andra oönskade nukleinsyror som kan störa efterföljande tillämpningar.

Isolering. Det finns ett antal olika sätt att isolera de intressanta nukleinsyrorna från det klara lysatet du skapat, vilka faller inom två huvudkategorier: lösningsbaserade eller fasta lysat (se nästa avsnitt).

Koncentration. Efter att nukleinsyrorna har isolerats från alla andra föroreningar och utspädningsmedel presenteras de i ett högkoncentrerat eluat.

De två typerna av extraktion
Det finns två typer av nukleinsyraextraktion – lösningsbaserade metoder och fastfasmetoder. Den lösningsbaserade metoden är också känd som kemisk extraktionsmetod, eftersom den innebär att kemikalier används för att bryta ner cellen och komma åt nukleinmaterialet. Detta kan göras med antingen organiska föreningar som fenol och kloroform, eller de mindre skadliga och därför mer rekommenderade oorganiska föreningarna som proteinas K eller kiselgel.

Exempel på olika kemiska extraktionsmetoder för att bryta ner en cell inkluderar:

- Osmotisk membranruptur

- Enzymatisk nedbrytning av cellväggen

- Löslighet av membran

- Med tvättmedel

- Med alkalibehandling

Fastfastekniker, även kända som mekaniska metoder, innebär att man utnyttjar hur DNA interagerar med ett fast substrat. Genom att välja en kula eller molekyl som DNA:t binder till men inte analyten, är det möjligt att separera de två. Exempel på fastfasextraktionstekniker inkluderar användning av kiseldioxid och magnetiska kulor.

Magnetisk pärlutvinning förklarad

Metoden för extraktion av magnetiska pärlor
Potentialen för extraktion med hjälp av magnetiska pärlor uppmärksammades först i ett amerikanskt patent som inlämnades av Trevor Hawkins för forskningsinstitutionen Whitehead Institute. Detta patent bekräftade att det var möjligt att extrahera genetiskt material genom att binda det till en fast bärare, vilket skulle kunna vara en magnetisk pärla. Principen är att man använder en högfunktionaliserad magnetisk pärla som det genetiska materialet binder till, vilken sedan kan separeras från supernatanten genom att applicera en magnetisk kraft på utsidan av kärlet som innehåller provet.

Varför använda magnetisk pärlextraktion?
Tekniken för extraktion av magnetiska kulor blir allt vanligare på grund av den potential den har för snabba och effektiva extraktionsprocedurer. På senare tid har det skett utvecklingar av högfunktionaliserade magnetiska kulor med lämpliga buffertsystem, vilket har möjliggjort automatisering av extraktion av nukleinsyra och ett arbetsflöde som är mycket resurssnålt och kostnadseffektivt. Dessutom involverar inte metoder för extraktion av magnetiska kulor de centrifugeringssteg som kan orsaka skjuvkrafter som bryter upp längre DNA-bitar. Detta innebär att längre DNA-strängar förblir intakta, vilket är viktigt vid genomtestning.