Увод
Шта је екстракција нуклеинских киселина?
Најједноставније речено, екстракција нуклеинских киселина је уклањање РНК и/или ДНК из узорка и свег вишка који није потребан. Процес екстракције изолује нуклеинске киселине из узорка и даје их у облику концентрованог елуата, без разблаживача и загађивача који би могли утицати на било коју даљу примену.
Примене екстракције нуклеинских киселина
Пречишћене нуклеинске киселине се користе у мноштву различитих примена, у различитим индустријама. Здравство је вероватно област у којој се највише користе, при чему су пречишћена РНК и ДНК потребне за мноштво различитих сврха тестирања.
Примене екстракције нуклеинских киселина у здравству укључују:
- Секвенцирање следеће генерације (NGS)
- Генотипизација SNP-а заснована на амплификацији
- Генотипизација заснована на низовима
- Варење рестрикционим ензимима
- Анализе коришћењем модификујућих ензима (нпр. лигација и клонирање)
Постоје и друга подручја поред здравствене заштите где се користи екстракција нуклеинских киселина, укључујући, али не ограничавајући се на, тестирање очинства, форензику и геномику.
Кратка историја екстракције нуклеинских киселина
Екстракција ДНКдатира далеко у прошлост, а прву познату изолацију извршио је швајцарски лекар Фридрих Мишер 1869. године. Мишер се надао да ће решити основне принципе живота одређивањем хемијског састава ћелија. Након неуспеха са лимфоцитима, успео је да добије сирови талог ДНК из леукоцита пронађених у гноју на одбаченим завојима. То је урадио додавањем киселине, а затим алкалије у ћелију како би напустио цитоплазму ћелије, а затим је развио протокол за одвајање ДНК од осталих протеина.
Након Мишеровог револуционарног истраживања, многи други научници су наставили да унапређују и развијају технике за изоловање и пречишћавање ДНК. Едвин Џозеф Кон, научник за протеине, развио је многе технике за пречишћавање протеина током Другог светског рата. Био је одговоран за изоловање фракције серумског албумина крвне плазме, која је важна за одржавање осмотског притиска у крвним судовима. Ово је било кључно за одржавање војника у животу.
Године 1953, Франсис Крик је, заједно са Розалинд Френклин и Џејмсом Вотсоном, одредио структуру ДНК, показујући да је састављена од два ланца дугих ланаца нуклеинских киселина нуклеотида. Ово револуционарно откриће отворило је пут Меселсону и Шталу, који су успели да развију протокол центрифугирања у градијенту густине за изолацију ДНК из бактерије E. coli, демонстрирајући полуконзервативну репликацију ДНК током свог експеримента из 1958. године.
Технике екстракције нуклеинских киселина
Које су 4 фазе екстракције ДНК?
Све методе екстракције своде се на исте основне кораке.
Поремећај ћелијаОва фаза, позната и као ћелијска лиза, подразумева разградњу ћелијског зида и/или ћелијске мембране, како би се ослободиле интраћелијске течности које садрже нуклеинске киселине од интереса.
Уклањање нежељених остатака. Ово укључује мембранске липиде, протеине и друге нежељене нуклеинске киселине које могу ометати даље примене.
Изолација. Постоји низ различитих начина за изоловање нуклеинских киселина од интереса из пречишћеног лизата који сте креирали, који спадају у две главне категорије: на бази раствора или у чврстом стању (видети следећи одељак).
Концентрација. Након што су нуклеинске киселине изоловане од свих осталих загађивача и разблаживача, оне се презентују у високо концентрованом елуату.
Две врсте екстракције
Постоје две врсте екстракције нуклеинских киселина – методе засноване на раствору и методе у чврстом стању. Метод заснован на раствору познат је и као метод хемијске екстракције, јер подразумева употребу хемикалија за разградњу ћелије и приступ нуклеинском материјалу. То може бити коришћење органских једињења као што су фенол и хлороформ, или мање штетних и стога препоручљивијих неорганских једињења као што су протеиназа К или силика гел.
Примери различитих метода хемијске екстракције за разградњу ћелије укључују:
- Осмотско пуцање мембране
- Ензимско варење ћелијског зида
- Растварање мембране
- Са детерџентима
- Са алкалним третманом
Технике чврстог стања, познате и као механичке методе, подразумевају искоришћавање начина на који ДНК интерагује са чврстом подлогом. Одабиром перле или молекула за који ће се ДНК везати, али аналит неће, могуће је раздвојити та два. Примери техника екстракције у чврстој фази укључују употребу силицијум диоксида и магнетних перли.
Објашњење екстракције магнетних перли
Метода екстракције магнетних перли
Потенцијал за екстракцију помоћу магнетних перли први пут је препознат у америчком патенту који је поднео Тревор Хокинс, за истраживачку институцију Институт Вајтхед. Овај патент је потврдио да је могуће екстраховати генетски материјал везивањем за чврсти носач, који може бити магнетна перла. Принцип је да се користи високо функционализована магнетна перла на коју ће се генетски материјал везати, која се затим може одвојити од супернатанта применом магнетне силе на спољашњост посуде која држи узорак.
Зашто користити екстракцију магнетних перли?
Технологија екстракције магнетним куглицама постаје све распрострањенија, због потенцијала који има за брзе и ефикасне поступке екстракције. У скорије време дошло је до развоја високо функционализованих магнетних куглица са одговарајућим пуферским системима, што је омогућило аутоматизацију екстракције нуклеинских киселина и ток рада који је веома економичан и захтева мало ресурса. Такође, методе екстракције магнетним куглицама не укључују кораке центрифугирања који могу изазвати силе смицања које разбијају дуже делове ДНК. То значи да дужи ланци ДНК остају нетакнути, што је важно у геномском тестирању.
Време објаве: 25. новембар 2022.