Введение
Что такое выделение нуклеиновых кислот?
Проще говоря, извлечение нуклеиновых кислот — это удаление РНК и/или ДНК из образца и всего лишнего, что не нужно. Процесс извлечения изолирует нуклеиновые кислоты из образца и выдает их в виде концентрированного элюата, свободного от разбавителей и загрязняющих веществ, которые могли бы повлиять на любые последующие приложения.
Применение экстракции нуклеиновых кислот
Очищенные нуклеиновые кислоты используются во множестве различных приложений, охватывающих множество различных отраслей. Здравоохранение, пожалуй, является областью, где они используются больше всего, поскольку очищенные РНК и ДНК требуются для множества различных целей тестирования.
Применение экстракции нуклеиновых кислот в здравоохранении включает:
- Секвенирование нового поколения (NGS)
- Генотипирование SNP на основе амплификации
- Генотипирование на основе массива
- Расщепление ферментами рестрикции
- Анализы с использованием модифицирующих ферментов (например, лигирование и клонирование)
Помимо здравоохранения существуют и другие области, где используется извлечение нуклеиновых кислот, включая, помимо прочего, тестирование на отцовство, криминалистику и геномику.
Краткая история выделения нуклеиновых кислот
Извлечение ДНКИстория уходит корнями в далекое прошлое, и первое известное выделение было выполнено швейцарским врачом Фридрихом Мишером в 1869 году. Мишер надеялся разгадать фундаментальные принципы жизни, определив химический состав клеток. После неудачи с лимфоцитами он смог получить грубый осадок ДНК из лейкоцитов, обнаруженных в гное на выброшенных бинтах. Он сделал это, добавив кислоту, а затем щелочь к клетке, чтобы оставить цитоплазму клетки, а затем разработал протокол для отделения ДНК от других белков.
После новаторских исследований Мишера многие другие ученые продолжили развивать и развивать методы выделения и очистки ДНК. Эдвин Джозеф Кон, ученый, изучающий белки, разработал множество методов очистки белков во время Второй мировой войны. Он отвечал за выделение фракции сывороточного альбумина плазмы крови, которая важна для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах. Это имело решающее значение для сохранения жизни солдат.
В 1953 году Фрэнсис Крик вместе с Розалинд Франклин и Джеймсом Уотсоном определили структуру ДНК, показав, что она состоит из двух цепей длинных цепей нуклеотидов нуклеиновых кислот. Это прорывное открытие проложило путь для Мезельсона и Шталя, которые смогли разработать протокол центрифугирования в градиенте плотности для выделения ДНК из бактерий E. Coli, поскольку они продемонстрировали полуконсервативную репликацию ДНК во время своего эксперимента 1958 года.
Методы извлечения нуклеиновых кислот
Каковы 4 этапа извлечения ДНК?
Все методы экстракции сводятся к одним и тем же основным этапам.
Разрушение клеток. Эта стадия, также известная как лизис клеток, включает разрушение клеточной стенки и/или клеточной мембраны с целью высвобождения внутриклеточных жидкостей, содержащих интересующие нуклеиновые кислоты.
Удаление нежелательного мусора. Сюда входят мембранные липиды, белки и другие нежелательные нуклеиновые кислоты, которые могут мешать последующим приложениям.
Изоляция. Существует ряд различных способов выделения интересующих вас нуклеиновых кислот из очищенного лизата, который вы создали, которые делятся на две основные категории: на основе раствора или в твердом состоянии (см. следующий раздел).
Концентрация. После того, как нуклеиновые кислоты были изолированы от всех других примесей и разбавителей, они представлены в высококонцентрированном элюате.
Два типа извлечения
Существует два типа экстракции нуклеиновых кислот — методы на основе растворов и методы на основе твердого тела. Метод на основе растворов также известен как метод химической экстракции, поскольку он включает использование химикатов для разрушения клетки и доступа к нуклеиновому материалу. Это может быть использование либо органических соединений, таких как фенол и хлороформ, либо менее вредных и поэтому более рекомендуемых неорганических соединений, таких как протеиназа К или силикагель.
Примеры различных методов химической экстракции для разрушения клетки включают в себя:
- Осмотический разрыв мембраны
- Ферментативное переваривание клеточной стенки
- Растворение мембраны
- С моющими средствами
- С щелочной обработкой
Методы твердофазной экстракции, также известные как механические методы, включают использование того, как ДНК взаимодействует с твердым субстратом. Выбрав шарик или молекулу, с которой ДНК будет связываться, а аналит — нет, можно разделить их. Примеры методов твердофазной экстракции, включая использование кремниевых и магнитных шариков.
Объяснение процесса извлечения магнитных шариков
Метод извлечения магнитных шариков
Потенциал извлечения с использованием магнитных шариков был впервые признан в патенте США, поданном Тревором Хокинсом для исследовательского института Whitehead Institute. В этом патенте признавалось, что можно извлекать генетический материал, связывая его с твердым носителем, которым может быть магнитный шарик. Принцип заключается в том, что вы используете высокофункционализированный магнитный шарик, с которым связывается генетический материал, который затем может быть отделен от супернатанта путем приложения магнитной силы к внешней стороне сосуда, содержащего образец.
Зачем использовать метод магнитной экстракции?
Технология извлечения магнитных шариков становится все более распространенной из-за ее потенциала для быстрых и эффективных процедур извлечения. В последнее время были разработаны высокофункциональные магнитные шарики с подходящими буферными системами, которые сделали возможным автоматизацию извлечения нуклеиновых кислот и рабочий процесс, который является очень ресурсосберегающим и экономически эффективным. Кроме того, методы извлечения магнитных шариков не включают этапы центрифугирования, которые могут вызывать сдвигающие силы, которые разрывают более длинные фрагменты ДНК. Это означает, что более длинные нити ДНК остаются нетронутыми, что важно при геномном тестировании.
Время публикации: 25 ноября 2022 г.