Introdução
O que é extração de ácido nucleico?
Em termos mais simples, a extração de ácidos nucleicos consiste na remoção do RNA e/ou DNA de uma amostra, bem como de todo o excesso desnecessário. O processo de extração isola os ácidos nucleicos de uma amostra e os produz na forma de um eluato concentrado, livre de diluentes e contaminantes que possam afetar quaisquer aplicações subsequentes.
Aplicações da Extração de Ácido Nucleico
Ácidos nucleicos purificados são usados em uma infinidade de aplicações diferentes, abrangendo diversos setores. A área da saúde é talvez a mais utilizada, com RNA e DNA purificados necessários para uma série de finalidades de teste diferentes.
As aplicações da extração de ácido nucleico na área da saúde incluem:
- Sequenciamento de Próxima Geração (NGS)
- Genotipagem de SNP baseada em amplificação
- Genotipagem baseada em array
- Digestão por Enzimas de Restrição
- Análises utilizando Enzimas Modificadoras (ex. Ligação e Clonagem)
Há também outros campos além da saúde onde a extração de ácido nucleico é usada, incluindo, mas não se limitando a, testes de paternidade, ciência forense e genômica.
Uma breve história da extração de ácido nucleico
Extração de DNAremonta a muito tempo, com o primeiro isolamento conhecido tendo sido realizado por um médico suíço chamado Friedrich Miescher em 1869. Miescher esperava resolver os princípios fundamentais da vida determinando a composição química das células. Após fracassar com linfócitos, ele conseguiu obter um precipitado bruto de DNA a partir de leucócitos encontrados no pus de bandagens descartadas. Ele fez isso adicionando ácido e, em seguida, álcali à célula para que ela deixasse o citoplasma da célula, e então desenvolveu um protocolo para separar o DNA das outras proteínas.
Após a pesquisa inovadora de Miescher, muitos outros cientistas avançaram e desenvolveram técnicas para isolar e purificar DNA. Edwin Joseph Cohn, um cientista especializado em proteínas, desenvolveu diversas técnicas para purificação de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial. Ele foi responsável por isolar a fração de albumina sérica do plasma sanguíneo, importante para manter a pressão osmótica nos vasos sanguíneos. Isso foi crucial para manter os soldados vivos.
Em 1953, Francis Crick, juntamente com Rosalind Franklin e James Watson, determinaram a estrutura do DNA, mostrando que ele era composto por duas fitas de longas cadeias de nucleotídeos de ácido nucleico. Essa descoberta revolucionária abriu caminho para Meselson e Stahl, que desenvolveram um protocolo de centrifugação em gradiente de densidade para isolar o DNA da bactéria E. coli, demonstrando a replicação semiconservativa do DNA em seu experimento de 1958.
Técnicas de Extração de Ácido Nucleico
Quais são os 4 estágios da extração de DNA?
Todos os métodos de extração se resumem às mesmas etapas fundamentais.
Ruptura celular. Esta etapa, também conhecida como lise celular, envolve a quebra da parede celular e/ou da membrana celular, a fim de liberar os fluidos intracelulares contendo os ácidos nucleicos de interesse.
Remoção de detritos indesejados. Isso inclui lipídios de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos indesejados que podem interferir em aplicações posteriores.
Isolamento. Existem várias maneiras diferentes de isolar os ácidos nucleicos de interesse do lisado clarificado que você criou, que se enquadram em duas categorias principais: em solução ou em estado sólido (veja a próxima seção).
Concentração. Após os ácidos nucleicos serem isolados de todos os outros contaminantes e diluentes, eles são apresentados em um eluato altamente concentrado.
Os dois tipos de extração
Existem dois tipos de extração de ácido nucleico: métodos baseados em solução e métodos em estado sólido. O método baseado em solução também é conhecido como método de extração química, pois envolve o uso de substâncias químicas para decompor a célula e acessar o material nucleico. Isso pode ser feito utilizando compostos orgânicos, como fenol e clorofórmio, ou compostos inorgânicos menos nocivos e, portanto, mais recomendados, como a proteinase K ou sílica gel.
Exemplos de diferentes métodos de extração química para quebrar uma célula incluem:
- Ruptura osmótica da membrana
- Digestão enzimática da parede celular
- Solubilização da membrana
- Com detergentes
- Com tratamento alcalino
Técnicas de estado sólido, também conhecidas como métodos mecânicos, envolvem a exploração de como o DNA interage com um substrato sólido. Selecionando uma esfera ou molécula à qual o DNA se ligará, mas o analito não, é possível separar os dois. Exemplos de técnicas de extração em fase sólida incluem o uso de sílica e esferas magnéticas.
Extração de esferas magnéticas explicada
O método de extração de esferas magnéticas
O potencial da extração usando esferas magnéticas foi reconhecido pela primeira vez em uma patente americana registrada por Trevor Hawkins, para o Instituto Whitehead de pesquisa. Essa patente reconhecia a possibilidade de extrair material genético ligando-o a um suporte sólido, que poderia ser uma esfera magnética. O princípio é usar uma esfera magnética altamente funcionalizada à qual o material genético se ligará, podendo então ser separado do sobrenadante pela aplicação de uma força magnética na parte externa do recipiente que contém a amostra.
Por que usar extração magnética de esferas?
A tecnologia de extração por esferas magnéticas está se tornando cada vez mais prevalente devido ao seu potencial para procedimentos de extração rápidos e eficientes. Recentemente, foram desenvolvidos esferas magnéticas altamente funcionalizadas com sistemas de tampão adequados, o que possibilitou a automação da extração de ácidos nucleicos e um fluxo de trabalho com baixo consumo de recursos e baixo custo. Além disso, os métodos de extração por esferas magnéticas não envolvem as etapas de centrifugação, que podem causar forças de cisalhamento que rompem pedaços maiores de DNA. Isso significa que as fitas mais longas de DNA permanecem intactas, o que é importante em testes genômicos.
Horário da publicação: 25/11/2022