Wstęp
Czym jest ekstrakcja kwasów nukleinowych?
Najprościej rzecz ujmując, ekstrakcja kwasu nukleinowego polega na usunięciu RNA i/lub DNA z próbki oraz całego nadmiaru, który nie jest konieczny. Proces ekstrakcji izoluje kwasy nukleinowe z próbki i daje je w postaci skoncentrowanego eluatu, wolnego od rozcieńczalników i zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na dalsze zastosowania.
Zastosowania ekstrakcji kwasów nukleinowych
Oczyszczone kwasy nukleinowe są wykorzystywane w wielu różnych zastosowaniach, w wielu różnych branżach. Opieka zdrowotna jest prawdopodobnie obszarem, w którym jest najczęściej wykorzystywana, a oczyszczone RNA i DNA są wymagane do wielu różnych celów testowych.
Zastosowania ekstrakcji kwasów nukleinowych w opiece zdrowotnej obejmują:
- Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS)
- Genotypowanie SNP oparte na amplifikacji
- Genotypowanie oparte na tablicach
- Trawienie enzymami restrykcyjnymi
- Analizy z wykorzystaniem enzymów modyfikujących (np. ligacja i klonowanie)
Istnieją również inne dziedziny poza opieką zdrowotną, w których stosuje się ekstrakcję kwasów nukleinowych, m.in.: testy na ojcostwo, medycyna sądowa i genomika.
Krótka historia ekstrakcji kwasów nukleinowych
Ekstrakcja DNAsięga daleko wstecz, a pierwszą znaną izolację przeprowadził szwajcarski lekarz o nazwisku Friedrich Miescher w 1869 roku. Miescher miał nadzieję rozwiązać podstawowe zasady życia poprzez określenie składu chemicznego komórek. Po niepowodzeniu z limfocytami udało mu się uzyskać surowy osad DNA z leukocytów znalezionych w ropie na porzuconych bandażach. Dokonał tego, dodając kwas, a następnie zasadę do komórki, aby opuścić cytoplazmę komórki, a następnie opracował protokół oddzielania DNA od innych białek.
Po przełomowych badaniach Mieschera wielu innych naukowców kontynuowało prace nad technikami izolowania i oczyszczania DNA. Edwin Joseph Cohn, naukowiec zajmujący się białkami, opracował wiele technik oczyszczania białek podczas II wojny światowej. Był odpowiedzialny za wyizolowanie frakcji albuminy surowicy krwi, która jest ważna dla utrzymania ciśnienia osmotycznego w naczyniach krwionośnych. Miało to kluczowe znaczenie dla utrzymania żołnierzy przy życiu.
W 1953 r. Francis Crick wraz z Rosalind Franklin i Jamesem Watsonem ustalili strukturę DNA, wykazując, że składa się ona z dwóch pasm długich łańcuchów nukleotydów kwasu nukleinowego. To przełomowe odkrycie utorowało drogę Meselsonowi i Stahlowi, którzy byli w stanie opracować protokół wirowania w gradiencie gęstości, aby wyizolować DNA z bakterii E. coli, ponieważ zademonstrowali półkonserwatywną replikację DNA podczas swojego eksperymentu w 1958 r.
Techniki ekstrakcji kwasów nukleinowych
Jakie są 4 etapy ekstrakcji DNA?
Wszystkie metody ekstrakcji sprowadzają się do tych samych podstawowych kroków.
Zakłócenie komórekEtap ten, znany również jako liza komórki, obejmuje rozkład ściany komórkowej i/lub błony komórkowej w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowych płynów zawierających interesujące kwasy nukleinowe.
Usuwanie niepożądanych zanieczyszczeń. Obejmuje to lipidy błonowe, białka i inne niepożądane kwasy nukleinowe, które mogą zakłócać dalsze zastosowania.
Izolacja. Istnieje wiele różnych sposobów na wyizolowanie interesujących kwasów nukleinowych z oczyszczonego lizatu, który stworzyłeś, które mieszczą się w dwóch głównych kategoriach: oparte na roztworze lub w stanie stałym (patrz następna sekcja).
Koncentracja. Po wyizolowaniu kwasów nukleinowych ze wszystkich innych zanieczyszczeń i rozcieńczalników, są one prezentowane w wysoce skoncentrowanym eluacie.
Dwa rodzaje ekstrakcji
Istnieją dwa rodzaje ekstrakcji kwasu nukleinowego – metody oparte na roztworach i metody w stanie stałym. Metoda oparta na roztworach jest również znana jako metoda ekstrakcji chemicznej, ponieważ polega na użyciu chemikaliów do rozbicia komórki i uzyskania dostępu do materiału nukleinowego. Może to być użycie związków organicznych, takich jak fenol i chloroform, lub mniej szkodliwych, a zatem bardziej zalecanych związków nieorganicznych, takich jak proteinaza K lub żel krzemionkowy.
Przykłady różnych metod ekstrakcji chemicznej służących rozbiciu komórki obejmują:
- Osmotyczne pęknięcie błony
- Enzymatyczne trawienie ściany komórkowej
- Solubilizacja błony
- Z detergentami
- Z obróbką alkaliczną
Techniki stanu stałego, znane również jako metody mechaniczne, obejmują wykorzystanie interakcji DNA z podłożem stałym. Wybierając koralik lub cząsteczkę, do której DNA się zwiąże, ale analit nie, można rozdzielić te dwa elementy. Przykłady technik ekstrakcji w fazie stałej obejmują użycie krzemionki i koralików magnetycznych.
Wyjaśnienie ekstrakcji kulek magnetycznych
Metoda ekstrakcji kulek magnetycznych
Potencjał ekstrakcji przy użyciu kulek magnetycznych został po raz pierwszy rozpoznany w patencie USA złożonym przez Trevora Hawkinsa dla instytutu badawczego Whitehead Institute. Patent ten potwierdzał, że możliwe jest wyekstrahowanie materiału genetycznego poprzez związanie go ze stałym nośnikiem, którym może być kulka magnetyczna. Zasada polega na tym, że używa się wysoce funkcjonalnej kulki magnetycznej, do której przywiązuje się materiał genetyczny, a następnie można ją oddzielić od supernatantu, stosując siłę magnetyczną na zewnątrz naczynia, w którym znajduje się próbka.
Dlaczego warto stosować ekstrakcję za pomocą kulek magnetycznych?
Technologia ekstrakcji kulek magnetycznych staje się coraz bardziej powszechna ze względu na potencjał, jaki oferuje w przypadku szybkich i wydajnych procedur ekstrakcji. W ostatnich czasach nastąpił rozwój wysoce funkcjonalnych kulek magnetycznych z odpowiednimi systemami buforowymi, które umożliwiły automatyzację ekstrakcji kwasów nukleinowych i przepływ pracy, który jest bardzo zasobooszczędny i opłacalny. Ponadto metody ekstrakcji kulek magnetycznych nie obejmują etapów wirowania, które mogą powodować siły ścinające, które rozbijają dłuższe fragmenty DNA. Oznacza to, że dłuższe nici DNA pozostają nienaruszone, co jest ważne w testach genomicznych.
Czas publikacji: 25-11-2022