Nucleïnezuurextractie en de magnetische kralenmethode

Invoering

Wat is nucleïnezuurextractie?

Simpel gezegd is nucleïnezuurextractie het verwijderen van RNA en/of DNA uit een monster en al het overtollige dat niet nodig is. Het extractieproces isoleert de nucleïnezuren uit een monster en levert ze op in de vorm van een geconcentreerd eluaat, vrij van verdunningsmiddelen en verontreinigingen die eventuele latere toepassingen zouden kunnen beïnvloeden.

Toepassingen van nucleïnezuurextractie

Gezuiverde nucleïnezuren worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen, verspreid over diverse sectoren. De gezondheidszorg is misschien wel de sector waar het het meest wordt gebruikt, aangezien gezuiverd RNA en DNA nodig zijn voor een groot aantal uiteenlopende testdoeleinden.

Toepassingen van nucleïnezuurextractie in de gezondheidszorg zijn onder meer:

- PCR- en qPCR-amplificatie

- Volgende generatie sequencing (NGS)

- Amplificatie-gebaseerde SNP-genotypering

- Array-gebaseerde genotypering

- Restrictie-enzymvertering

- Analyses met behulp van modificerende enzymen (bijv. ligatie en klonen)

Er zijn ook andere gebieden buiten de gezondheidszorg waar nucleïnezuurextractie wordt gebruikt, waaronder maar niet beperkt tot vaderschapstesten, forensisch onderzoek en genomica.

Een korte geschiedenis van nucleïnezuurextractie

DNA-extractieDe eerste bekende isolatie werd in 1869 uitgevoerd door een Zwitserse arts genaamd Friedrich Miescher. Miescher hoopte de fundamentele principes van het leven te ontrafelen door de chemische samenstelling van cellen te bepalen. Nadat hij met lymfocyten had gefaald, slaagde hij erin een ruwe DNA-precipitatie te verkrijgen uit leukocyten die in pus op weggegooide verbanden waren aangetroffen. Hij deed dit door zuur en vervolgens base aan de cel toe te voegen om het cytoplasma van de cel te verlaten, en ontwikkelde vervolgens een protocol om het DNA van de andere eiwitten te scheiden.

Na Mieschers baanbrekende onderzoek hebben vele andere wetenschappers technieken ontwikkeld om DNA te isoleren en te zuiveren. Edwin Joseph Cohn, een eiwitwetenschapper, ontwikkelde tijdens de Tweede Wereldoorlog vele technieken voor eiwitzuivering. Hij was verantwoordelijk voor de isolatie van de serumalbuminefractie van bloedplasma, belangrijk voor het handhaven van de osmotische druk in de bloedvaten. Dit was cruciaal om soldaten in leven te houden.

In 1953 bepaalde Francis Crick, samen met Rosalind Franklin en James Watson, de structuur van DNA en toonde aan dat het bestond uit twee strengen lange ketens van nucleïnezuurnucleotiden. Deze baanbrekende ontdekking maakte de weg vrij voor Meselson en Stahl, die een dichtheidsgradiëntcentrifugatieprotocol ontwikkelden om DNA te isoleren uit E. coli-bacteriën. Tijdens hun experiment in 1958 demonstreerden ze de semiconservatieve replicatie van DNA.

Technieken voor nucleïnezuurextractie

Wat zijn de 4 fasen van DNA-extractie?
Alle extractiemethoden komen neer op dezelfde basisstappen.

CelverstoringDeze fase, ook wel cellyse genoemd, omvat het afbreken van de celwand en/of het celmembraan, om de intracellulaire vloeistoffen vrij te maken die de nucleïnezuren van belang bevatten.

Verwijdering van ongewenste rommel. Dit omvat membraanlipiden, eiwitten en andere ongewenste nucleïnezuren die de verdere toepassing kunnen verstoren.

Isolatie. Er zijn verschillende manieren om de gewenste nucleïnezuren te isoleren uit het door u gecreëerde, geklaarde lysaat. Deze vallen in twee hoofdcategorieën: oplossingsgebaseerd of vaste toestand (zie volgende sectie).

Concentratie. Nadat de nucleïnezuren zijn geïsoleerd van alle andere verontreinigingen en verdunningsmiddelen, worden ze gepresenteerd in een sterk geconcentreerd eluaat.

De twee soorten extractie
Er zijn twee soorten nucleïnezuurextractie: oplossingsgebaseerde methoden en vastestofmethoden. De oplossingsgebaseerde methode staat ook bekend als de chemische extractiemethode, omdat hierbij chemicaliën worden gebruikt om de cel af te breken en het nucleïnezuurmateriaal te ontsluiten. Dit kan met behulp van organische verbindingen zoals fenol en chloroform, of de minder schadelijke en daarom meer aanbevolen anorganische verbindingen zoals proteïnase K of silicagel.

Voorbeelden van verschillende chemische extractiemethoden om een ​​cel af te breken zijn:

- Osmotische breuk van het membraan

- Enzymatische vertering van de celwand

- Oplosbaarheid van membraan

- Met reinigingsmiddelen

- Met alkalibehandeling

Vaste-fase-technieken, ook wel mechanische methoden genoemd, benutten de interactie tussen DNA en een vast substraat. Door een kraal of molecuul te selecteren waaraan het DNA zich wel bindt, maar de analyt niet, is het mogelijk om de twee te scheiden. Voorbeelden van vaste-fase-extractietechnieken zijn onder andere het gebruik van silica en magnetische kralen.

Magnetische kraalextractie uitgelegd

De magnetische kralenextractiemethode
De mogelijkheden voor extractie met behulp van magnetische kralen werden voor het eerst erkend in een Amerikaans patent dat Trevor Hawkins indiende voor het onderzoeksinstituut Whitehead Institute. Dit patent erkende dat het mogelijk was om genetisch materiaal te extraheren door het te binden aan een vaste drager, bijvoorbeeld een magnetische kraal. Het principe is dat je een sterk gefunctionaliseerde magnetische kraal gebruikt waaraan het genetische materiaal zich bindt. Deze kan vervolgens van de supernatant worden gescheiden door een magnetische kracht uit te oefenen op de buitenkant van het vat waarin het monster zich bevindt.

Waarom magnetische kralenextractie gebruiken?
De technologie voor de extractie van magnetische kralen wordt steeds populairder vanwege de potentie die het biedt voor snelle en efficiënte extractieprocedures. Recentelijk zijn er ontwikkelingen geweest van zeer gefunctionaliseerde magnetische kralen met geschikte buffersystemen, die automatisering van de extractie van nucleïnezuren mogelijk hebben gemaakt en een workflow hebben gecreëerd die zeer resource-arm en kostenefficiënt is. Bovendien maken magnetische kralenextractiemethoden geen gebruik van centrifugatiestappen die schuifkrachten kunnen veroorzaken die langere DNA-stukken breken. Dit betekent dat langere DNA-strengen intact blijven, wat belangrijk is bij genomics-testen.