न्यूक्लिक अॅसिड काढणे आणि चुंबकीय मणी पद्धत

परिचय

न्यूक्लिक अॅसिड एक्सट्रॅक्शन म्हणजे काय?

अगदी सोप्या भाषेत सांगायचे तर, न्यूक्लिक अॅसिड एक्सट्रॅक्शन म्हणजे नमुन्यातून आरएनए आणि/किंवा डीएनए आणि आवश्यक नसलेले सर्व अतिरिक्त काढून टाकणे. एक्सट्रॅक्शनची प्रक्रिया नमुन्यातून न्यूक्लिक अॅसिड वेगळे करते आणि त्यांना एका केंद्रित एल्युएटच्या स्वरूपात देते, जे कोणत्याही डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगांवर परिणाम करू शकणार्‍या डायल्युएंट्स आणि दूषित घटकांपासून मुक्त असते.

न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याचे उपयोग

शुद्धीकृत न्यूक्लिक अॅसिडचा वापर विविध उद्योगांमध्ये केला जातो. आरोग्यसेवा हे कदाचित असे क्षेत्र आहे जिथे ते सर्वात जास्त वापरले जाते, शुद्धीकृत आरएनए आणि डीएनए विविध किंवा वेगवेगळ्या चाचणी उद्देशांसाठी आवश्यक असतात.

आरोग्यसेवेमध्ये न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याच्या वापरामध्ये हे समाविष्ट आहे:

- पीसीआर आणि क्यूपीसीआर प्रवर्धन

- नेक्स्ट जनरेशन सिक्वेन्सिंग (NGS)

- अॅम्प्लिफिकेशन-आधारित SNP जीनोटाइपिंग

- अ‍ॅरे-आधारित जीनोटाइपिंग

- प्रतिबंध एंजाइम पचन

- सुधारित एन्झाईम्स वापरून विश्लेषण करते (उदा. बंधन आणि क्लोनिंग)

आरोग्यसेवेव्यतिरिक्त इतरही क्षेत्रे आहेत जिथे न्यूक्लिक अॅसिड निष्कर्षण वापरले जाते, ज्यामध्ये पितृत्व चाचणी, फॉरेन्सिक्स आणि जीनोमिक्स यांचा समावेश आहे परंतु त्यापुरते मर्यादित नाही.

न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याचा संक्षिप्त इतिहास

डीएनए निष्कर्षणहे खूप जुने आहे, १८६९ मध्ये फ्रेडरिक मिशर नावाच्या स्विस डॉक्टरने पहिले ज्ञात आयसोलेशन केले होते. मिशर पेशींची रासायनिक रचना ठरवून जीवनाची मूलभूत तत्त्वे सोडवण्याची आशा करत होते. लिम्फोसाइट्समध्ये अपयशी ठरल्यानंतर, तो टाकून दिलेल्या पट्ट्यांवर पूमध्ये आढळणाऱ्या ल्युकोसाइट्समधून डीएनएचा एक कच्चा अवक्षेपण मिळवू शकला. त्याने पेशीच्या सायटोप्लाझममधून बाहेर पडण्यासाठी पेशीमध्ये आम्ल आणि नंतर अल्कली घालून हे केले आणि नंतर डीएनएला इतर प्रथिनांपासून वेगळे करण्यासाठी एक प्रोटोकॉल विकसित केला.

मिशरच्या अभूतपूर्व संशोधनानंतर, इतर अनेक शास्त्रज्ञांनी डीएनए वेगळे करण्यासाठी आणि शुद्ध करण्यासाठी तंत्रे विकसित करण्यासाठी प्रगती केली आहे. एडविन जोसेफ कोहन, एक प्रथिने शास्त्रज्ञ यांनी दुसऱ्या महायुद्धादरम्यान प्रथिने शुद्धीकरणासाठी अनेक तंत्रे विकसित केली. रक्तवाहिन्यांमधील ऑस्मोटिक दाब राखण्यासाठी महत्त्वपूर्ण असलेल्या रक्त प्लाझ्माच्या सीरम अल्ब्युमिन अंशाचे पृथक्करण करण्यासाठी ते जबाबदार होते. सैनिकांना जिवंत ठेवण्यासाठी हे अत्यंत महत्त्वाचे होते.

१९५३ मध्ये, फ्रान्सिस क्रिक यांनी रोझालिंड फ्रँकलिन आणि जेम्स वॉटसन यांच्यासमवेत डीएनएची रचना निश्चित केली, ज्यामुळे ते न्यूक्लिक अॅसिड न्यूक्लियोटाइड्सच्या दोन लांब साखळ्यांनी बनलेले असल्याचे दिसून आले. या अभूतपूर्व शोधामुळे मेसेल्सन आणि स्टॅहल यांना ई. कोलाई बॅक्टेरियापासून डीएनए वेगळे करण्यासाठी घनता ग्रेडियंट सेंट्रीफ्यूगेशन प्रोटोकॉल विकसित करण्याचा मार्ग मोकळा झाला कारण त्यांनी १९५८ च्या प्रयोगादरम्यान डीएनएची अर्ध-संरक्षित प्रतिकृती दाखवली.

न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याच्या पद्धती

डीएनए काढण्याचे ४ टप्पे कोणते आहेत?
सर्व निष्कर्षण पद्धती एकाच मूलभूत पायऱ्यांवर अवलंबून असतात.

पेशी व्यत्यय. या टप्प्याला, ज्याला सेल लिसिस असेही म्हणतात, त्यात पेशी भिंत आणि/किंवा पेशी पडदा तोडणे समाविष्ट असते, ज्यामुळे स्वारस्य असलेल्या न्यूक्लिक अॅसिड असलेले पेशीय द्रव बाहेर पडतात.

अवांछित कचरा काढून टाकणे. यामध्ये मेम्ब्रेन लिपिड्स, प्रथिने आणि इतर अवांछित न्यूक्लिक अॅसिड समाविष्ट आहेत जे प्रवाहाच्या प्रवाहात व्यत्यय आणू शकतात.

अलगाव. तुम्ही तयार केलेल्या क्लिअर केलेल्या लायसेटपासून स्वारस्य असलेल्या न्यूक्लिक अॅसिड वेगळे करण्याचे अनेक वेगवेगळे मार्ग आहेत, जे दोन मुख्य श्रेणींमध्ये येतात: द्रावणावर आधारित किंवा घन स्थिती (पुढील विभाग पहा).

एकाग्रता. न्यूक्लिक अॅसिड इतर सर्व दूषित घटकांपासून आणि सौम्य घटकांपासून वेगळे केल्यानंतर, ते एका अत्यंत केंद्रित एल्युएटमध्ये सादर केले जातात.

दोन प्रकारचे निष्कर्षण
न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याचे दोन प्रकार आहेत - द्रावणावर आधारित पद्धती आणि घन स्थिती पद्धती. द्रावणावर आधारित पद्धतीला रासायनिक काढण्याची पद्धत असेही म्हणतात, कारण त्यात पेशी तोडण्यासाठी आणि न्यूक्लिक पदार्थापर्यंत पोहोचण्यासाठी रसायनांचा वापर केला जातो. हे फिनॉल आणि क्लोरोफॉर्म सारख्या सेंद्रिय संयुगे किंवा प्रोटीनेज के किंवा सिलिका जेल सारख्या कमी हानिकारक आणि म्हणून अधिक शिफारस केलेल्या अजैविक संयुगे वापरून केले जाऊ शकते.

पेशी तोडण्यासाठी वेगवेगळ्या रासायनिक निष्कर्षण पद्धतींची उदाहरणे खालीलप्रमाणे आहेत:

- पडद्याचे ऑस्मोटिक फुटणे

- पेशी भिंतीचे एंजाइमॅटिक पचन

- पडद्याचे विद्राव्यीकरण

- डिटर्जंट्ससह

- अल्कली उपचारांसह

सॉलिड स्टेट तंत्रे, ज्यांना यांत्रिक पद्धती म्हणूनही ओळखले जाते, त्यात डीएनए घन सब्सट्रेटशी कसा संवाद साधतो हे शोधणे समाविष्ट आहे. डीएनए ज्यावर बांधला जाईल परंतु विश्लेषक बांधणार नाही असा मणी किंवा रेणू निवडून, दोन्ही वेगळे करणे शक्य आहे. सिलिका आणि चुंबकीय मणी वापरणे यासह सॉलिड-फेज निष्कर्षण तंत्रांची उदाहरणे.

चुंबकीय मणी काढण्याचे स्पष्टीकरण

चुंबकीय मणी काढण्याची पद्धत
चुंबकीय मणी वापरून काढण्याच्या क्षमतेची ओळख पहिल्यांदा व्हाईटहेड इन्स्टिट्यूट संशोधन संस्थेसाठी ट्रेवर हॉकिन्स यांनी दाखल केलेल्या अमेरिकन पेटंटमध्ये झाली. या पेटंटमध्ये हे मान्य करण्यात आले की अनुवांशिक सामग्री एका घन आधार वाहकाशी बांधून काढणे शक्य आहे, जे चुंबकीय मणी असू शकते. तत्व असे आहे की तुम्ही एक अत्यंत कार्यात्मक चुंबकीय मणी वापरता ज्यावर अनुवांशिक सामग्री बांधली जाईल, ज्याला नंतर नमुना असलेल्या पात्राच्या बाहेरील बाजूस चुंबकीय शक्ती लागू करून सुपरनॅटंटपासून वेगळे केले जाऊ शकते.

चुंबकीय मणी काढण्याचे साधन का वापरावे?
चुंबकीय मणी काढण्याचे तंत्रज्ञान जलद आणि कार्यक्षम पद्धतीने काढण्याच्या क्षमतेमुळे अधिकाधिक प्रचलित होत आहे. अलिकडच्या काळात योग्य बफर सिस्टीमसह अत्यंत कार्यक्षम चुंबकीय मणी काढण्याचे तंत्रज्ञान विकसित झाले आहे, ज्यामुळे न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याचे ऑटोमेशन शक्य झाले आहे आणि एक कार्यप्रवाह खूप हलका आणि किफायतशीर आहे. तसेच, चुंबकीय मणी काढण्याच्या पद्धतींमध्ये सेंट्रीफ्यूगेशन पायऱ्यांचा समावेश नाही ज्यामुळे कातरणे होऊ शकते ज्यामुळे डीएनएचे लांब तुकडे तुटतात. याचा अर्थ असा की डीएनएचे लांब पट्टे अबाधित राहतात, जे जीनोमिक्स चाचणीमध्ये महत्वाचे आहे.