ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കലും കാന്തിക ബീഡ് രീതിയും

ആമുഖം

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ എന്താണ്?

ഏറ്റവും ലളിതമായി പറഞ്ഞാൽ, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ എന്നത് ഒരു സാമ്പിളിൽ നിന്ന് ആർ‌എൻ‌എയും ഡി‌എൻ‌എയും നീക്കം ചെയ്യുന്നതും ആവശ്യമില്ലാത്ത അധികമുള്ളതും നീക്കം ചെയ്യുന്നതുമാണ്. വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിൽ ഒരു സാമ്പിളിൽ നിന്ന് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും ഏതെങ്കിലും ഡൗൺസ്ട്രീം ആപ്ലിക്കേഷനുകളെ ബാധിച്ചേക്കാവുന്ന നേർപ്പിക്കലുകളിൽ നിന്നും മാലിന്യങ്ങളിൽ നിന്നും മുക്തമായ ഒരു സാന്ദ്രീകൃത എലുയേറ്റിന്റെ രൂപത്തിൽ അവ ലഭിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷന്റെ പ്രയോഗങ്ങൾ

ശുദ്ധീകരിച്ച ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ ഒന്നിലധികം വ്യത്യസ്ത വ്യവസായങ്ങളിലായി വിവിധ ആപ്ലിക്കേഷനുകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു. ആരോഗ്യ സംരക്ഷണ മേഖലയാണ് ഇത് ഏറ്റവും കൂടുതൽ ഉപയോഗിക്കുന്നത്, വ്യത്യസ്ത പരിശോധനാ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ശുദ്ധീകരിച്ച ആർ‌എൻ‌എയും ഡി‌എൻ‌എയും ആവശ്യമാണ്.

ആരോഗ്യ സംരക്ഷണത്തിൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന്റെ പ്രയോഗങ്ങളിൽ ഇവ ഉൾപ്പെടുന്നു:

- PCR ഉം qPCR ഉം ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ

- അടുത്ത തലമുറ സീക്വൻസിങ് (NGS)

- ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള എസ്എൻപി ജനിതക ടൈപ്പിംഗ്

- അറേ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ജനിതക ടൈപ്പിംഗ്

- നിയന്ത്രണം എൻസൈം ദഹനം

- മോഡിഫൈയിംഗ് എൻസൈമുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള വിശകലനം (ഉദാ. ലിഗേഷനും ക്ലോണിംഗും)

ആരോഗ്യ സംരക്ഷണത്തിനപ്പുറം ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന മറ്റ് മേഖലകളുമുണ്ട്, പിതൃത്വ പരിശോധന, ഫോറൻസിക്സ്, ജീനോമിക്സ് എന്നിവയുൾപ്പെടെ എന്നാൽ അതിൽ മാത്രം പരിമിതപ്പെടുത്താതെ.

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന്റെ ഒരു സംക്ഷിപ്ത ചരിത്രം

ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽവളരെ പഴക്കമുള്ളതാണ്, 1869-ൽ ഫ്രെഡറിക് മിഷർ എന്ന സ്വിസ് വൈദ്യനാണ് ആദ്യമായി ഒറ്റപ്പെടൽ നടത്തിയത്. കോശങ്ങളുടെ രാസഘടന നിർണ്ണയിച്ചുകൊണ്ട് ജീവിതത്തിന്റെ അടിസ്ഥാന തത്വങ്ങൾ പരിഹരിക്കാമെന്ന് മിഷർ പ്രതീക്ഷിച്ചിരുന്നു. ലിംഫോസൈറ്റുകളുടെ കാര്യത്തിൽ പരാജയപ്പെട്ടതിനുശേഷം, ഉപേക്ഷിക്കപ്പെട്ട ബാൻഡേജുകളിലെ പഴുപ്പിൽ കാണപ്പെടുന്ന ല്യൂക്കോസൈറ്റുകളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎയുടെ അസംസ്കൃത അവക്ഷിപ്തം നേടാൻ അദ്ദേഹത്തിന് കഴിഞ്ഞു. കോശത്തിന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസം വിടാൻ ആസിഡും പിന്നീട് ക്ഷാരവും കോശത്തിൽ ചേർത്താണ് അദ്ദേഹം ഇത് ചെയ്തത്, തുടർന്ന് മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎയെ വേർതിരിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രോട്ടോക്കോൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു.

മിഷറിന്റെ വിപ്ലവകരമായ ഗവേഷണത്തെത്തുടർന്ന്, മറ്റ് നിരവധി ശാസ്ത്രജ്ഞർ ഡിഎൻഎയെ ഒറ്റപ്പെടുത്തുന്നതിനും ശുദ്ധീകരിക്കുന്നതിനുമുള്ള സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിൽ മുന്നേറിയിട്ടുണ്ട്. രണ്ടാം ലോകമഹായുദ്ധകാലത്ത് പ്രോട്ടീൻ ശുദ്ധീകരണത്തിനായി നിരവധി സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ പ്രോട്ടീൻ ശാസ്ത്രജ്ഞനായ എഡ്വിൻ ജോസഫ് കോൺ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. രക്തക്കുഴലുകളിലെ ഓസ്മോട്ടിക് മർദ്ദം നിലനിർത്തുന്നതിൽ പ്രധാനമായ രക്ത പ്ലാസ്മയുടെ സെറം ആൽബുമിൻ അംശം വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിന് അദ്ദേഹം ഉത്തരവാദിയായിരുന്നു. സൈനികരെ ജീവനോടെ നിലനിർത്തുന്നതിന് ഇത് നിർണായകമായിരുന്നു.

1953-ൽ ഫ്രാൻസിസ് ക്രിക്ക്, റോസലിൻഡ് ഫ്രാങ്ക്ലിൻ, ജെയിംസ് വാട്സൺ എന്നിവർ ചേർന്ന് ഡിഎൻഎയുടെ ഘടന നിർണ്ണയിച്ചു, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുടെ രണ്ട് നീണ്ട ശൃംഖലകൾ ചേർന്നതാണെന്ന് കാണിച്ചു. ഈ മുന്നേറ്റ കണ്ടെത്തൽ മെസൽസണിനും സ്റ്റാലിനും വഴിയൊരുക്കി, 1958-ലെ പരീക്ഷണത്തിനിടെ ഡിഎൻഎയുടെ അർദ്ധ-യാഥാസ്ഥിതിക പകർപ്പ് പ്രദർശിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് ഇ. കോളി ബാക്ടീരിയയിൽ നിന്ന് ഡിഎൻഎയെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള സാന്ദ്രത ഗ്രേഡിയന്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ പ്രോട്ടോക്കോൾ വികസിപ്പിക്കാൻ അവർക്ക് കഴിഞ്ഞു.

ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ

ഡിഎൻഎ വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന്റെ 4 ഘട്ടങ്ങൾ ഏതൊക്കെയാണ്?
എല്ലാ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ രീതികളും ഒരേ അടിസ്ഥാന ഘട്ടങ്ങളിലേക്ക് ചുരുക്കിയിരിക്കുന്നു.

സെൽ തടസ്സംകോശ ലിസിസ് എന്നും അറിയപ്പെടുന്ന ഈ ഘട്ടത്തിൽ, കോശഭിത്തിയും/അല്ലെങ്കിൽ കോശ സ്തരവും തകർക്കുന്നതിലൂടെ, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ അടങ്ങിയ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ദ്രാവകങ്ങൾ പുറത്തുവിടുന്നു.

ആവശ്യമില്ലാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ നീക്കംചെയ്യൽ. ഇതിൽ മെംബ്രൻ ലിപിഡുകൾ, പ്രോട്ടീനുകൾ, മറ്റ് അനാവശ്യ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് താഴത്തെ പ്രയോഗങ്ങളെ തടസ്സപ്പെടുത്തും.

ഐസൊലേഷൻ. നിങ്ങൾ സൃഷ്ടിച്ച ക്ലിയർ ചെയ്ത ലൈസേറ്റിൽ നിന്ന് താൽപ്പര്യമുള്ള ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ നിരവധി വ്യത്യസ്ത മാർഗങ്ങളുണ്ട്, അവ രണ്ട് പ്രധാന വിഭാഗങ്ങൾക്കിടയിൽ വരുന്നു: ലായനി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളത് അല്ലെങ്കിൽ ഖരാവസ്ഥ (അടുത്ത വിഭാഗം കാണുക).

സാന്ദ്രത. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾ മറ്റെല്ലാ മാലിന്യങ്ങളിൽ നിന്നും നേർപ്പിക്കുന്നവയിൽ നിന്നും വേർതിരിച്ചെടുത്ത ശേഷം, അവ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയുള്ള എല്യൂട്ട് രൂപത്തിൽ അവതരിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു.

രണ്ട് തരം വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ
ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കലിന് രണ്ട് തരം ഉണ്ട് - ലായനി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതികളും സോളിഡ് സ്റ്റേറ്റ് രീതികളും. കോശത്തെ വിഘടിപ്പിച്ച് ന്യൂക്ലിക് വസ്തുക്കളിലേക്ക് പ്രവേശിക്കാൻ രാസവസ്തുക്കൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനാൽ ലായനി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള രീതിയെ കെമിക്കൽ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതി എന്നും വിളിക്കുന്നു. ഫിനോൾ, ക്ലോറോഫോം പോലുള്ള ജൈവ സംയുക്തങ്ങളോ പ്രോട്ടീനേസ് കെ അല്ലെങ്കിൽ സിലിക്ക ജെൽ പോലുള്ള ദോഷകരമല്ലാത്തതും അതിനാൽ കൂടുതൽ ശുപാർശ ചെയ്യപ്പെടുന്നതുമായ അജൈവ സംയുക്തങ്ങളോ ഇതിൽ ഉൾപ്പെടാം.

ഒരു കോശത്തെ തകർക്കുന്നതിനുള്ള വ്യത്യസ്ത രാസ വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ രീതികളുടെ ഉദാഹരണങ്ങളിൽ ഇവ ഉൾപ്പെടുന്നു:

- മെംബ്രണിന്റെ ഓസ്മോട്ടിക് വിള്ളൽ

- കോശഭിത്തിയുടെ എൻസൈമാറ്റിക് ദഹനം

- മെംബ്രണിന്റെ ലയനം

- ഡിറ്റർജന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച്

- ക്ഷാര ചികിത്സയോടെ

ഖരാവസ്ഥയിലുള്ള സാങ്കേതിക വിദ്യകൾ, മെക്കാനിക്കൽ രീതികൾ എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഡിഎൻഎ ഒരു ഖര അടിവസ്ത്രവുമായി എങ്ങനെ ഇടപഴകുന്നു എന്നത് ചൂഷണം ചെയ്യുന്നതിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഡിഎൻഎ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതും എന്നാൽ അനലൈറ്റ് ബന്ധിപ്പിക്കാത്തതുമായ ഒരു ബീഡ് അല്ലെങ്കിൽ തന്മാത്ര തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിലൂടെ, രണ്ടും വേർതിരിക്കാൻ കഴിയും. സോളിഡ്-ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ടെക്നിക്കുകളുടെ ഉദാഹരണങ്ങളിൽ സിലിക്ക, മാഗ്നറ്റിക് ബീഡുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.

കാന്തിക ബീഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ വിശദീകരിച്ചു

കാന്തിക ബീഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതി
വൈറ്റ്ഹെഡ് ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഗവേഷണ സ്ഥാപനത്തിനു വേണ്ടി ട്രെവർ ഹോക്കിൻസ് ഫയൽ ചെയ്ത യുഎസ് പേറ്റന്റിലാണ് കാന്തിക ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കാനുള്ള സാധ്യത ആദ്യമായി തിരിച്ചറിഞ്ഞത്. ഒരു സോളിഡ് സപ്പോർട്ട് കാരിയറുമായി ബന്ധിപ്പിച്ച് ജനിതക വസ്തുക്കൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ പേറ്റന്റ് അംഗീകരിച്ചു, അത് ഒരു കാന്തിക ബീഡാകാം. ജനിതക മെറ്റീരിയൽ ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഉയർന്ന പ്രവർത്തനക്ഷമതയുള്ള ഒരു കാന്തിക ബീഡ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു, തുടർന്ന് സാമ്പിൾ കൈവശം വച്ചിരിക്കുന്ന പാത്രത്തിന്റെ പുറത്ത് ഒരു കാന്തികബലം പ്രയോഗിച്ച് സൂപ്പർനാറ്റന്റിൽ നിന്ന് ഇത് വേർതിരിക്കാം എന്നതാണ് തത്വം.

എന്തിനാണ് മാഗ്നറ്റിക് ബീഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ ഉപയോഗിക്കുന്നത്?
വേഗത്തിലുള്ളതും കാര്യക്ഷമവുമായ എക്സ്ട്രാക്ഷൻ നടപടിക്രമങ്ങൾക്ക് മാഗ്നറ്റിക് ബീഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ സാങ്കേതികവിദ്യ കൂടുതൽ പ്രചാരത്തിലായിക്കൊണ്ടിരിക്കുകയാണ്. അനുയോജ്യമായ ബഫർ സിസ്റ്റങ്ങളുള്ള ഉയർന്ന പ്രവർത്തനക്ഷമതയുള്ള കാന്തിക ബീഡുകളുടെ വികസനം സമീപകാലത്ത് ഉണ്ടായിട്ടുണ്ട്, ഇത് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷന്റെ ഓട്ടോമേഷനും വളരെ ഭാരം കുറഞ്ഞതും ചെലവ് കുറഞ്ഞതുമായ ഒരു വർക്ക്ഫ്ലോയും സാധ്യമാക്കി. കൂടാതെ, മാഗ്നറ്റിക് ബീഡ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതികളിൽ ഡിഎൻഎയുടെ നീളമുള്ള കഷണങ്ങൾ തകർക്കുന്ന ഷിയർ ഫോഴ്‌സുകൾക്ക് കാരണമാകുന്ന സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ഘട്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നില്ല. ഇതിനർത്ഥം ഡിഎൻഎയുടെ നീളമുള്ള സ്ട്രോണ്ടുകൾ കേടുകൂടാതെയിരിക്കും, ഇത് ജീനോമിക്സ് പരിശോധനയിൽ പ്രധാനമാണ്.