Ievads
Kas ir nukleīnskābju ekstrakcija?
Vienkāršoti sakot, nukleīnskābju ekstrakcija ir RNS un/vai DNS atdalīšana no parauga, kā arī visa liekā atdalīšana. Ekstrakcijas procesā nukleīnskābes tiek izolētas no parauga un iegūtas koncentrēta eluāta veidā, kas nesatur atšķaidītājus un piesārņotājus, kas varētu ietekmēt jebkuru pakārtotu pielietojumu.
Nukleīnskābju ekstrakcijas pielietojumi
Attīrītas nukleīnskābes tiek izmantotas daudzos dažādos pielietojumos, aptverot daudzas un dažādas nozares. Veselības aprūpe, iespējams, ir joma, kurā tās tiek izmantotas visvairāk, jo attīrīta RNS un DNS ir nepieciešama dažādiem testēšanas mērķiem.
Nukleīnskābju ekstrakcijas pielietojums veselības aprūpē ietver:
- Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS)
- Uz amplifikāciju balstīta SNP genotipa noteikšana
- Uz masīviem balstīta genotipēšana
- Restrikcijas enzīmu gremošana
- Analīzes, izmantojot modificējošus enzīmus (piemēram, ligācija un klonēšana)
Papildus veselības aprūpei ir arī citas jomas, kurās tiek izmantota nukleīnskābju ekstrakcija, tostarp, bet ne tikai, paternitātes pārbaude, kriminālistika un genomika.
Īsa nukleīnskābju ekstrakcijas vēsture
DNS ekstrakcijaTas aizsākās sen, un pirmo zināmo izolāciju 1869. gadā veica Šveices ārsts Frīdrihs Mīšers. Mīšers cerēja atrisināt dzīvības pamatprincipus, nosakot šūnu ķīmisko sastāvu. Pēc neveiksmīga limfocītu atrašanas viņam izdevās iegūt neapstrādātas DNS nogulsnes no leikocītiem, kas tika atrasti uz izmestām pārsējiem esošajās strutās. Viņš to panāca, pievienojot šūnai skābi un pēc tam sārmu, lai izietu no šūnas citoplazmas, un pēc tam izstrādāja protokolu DNS atdalīšanai no citiem proteīniem.
Pēc Miesčera revolucionārajiem pētījumiem daudzi citi zinātnieki ir turpinājuši attīstīt un attīstīt DNS izolēšanas un attīrīšanas metodes. Edvins Džozefs Kons, olbaltumvielu zinātnieks, Otrā pasaules kara laikā izstrādāja daudzas olbaltumvielu attīrīšanas metodes. Viņš bija atbildīgs par asins plazmas seruma albumīna frakcijas izolēšanu, kas ir svarīga osmotiskā spiediena uzturēšanai asinsvados. Tas bija izšķiroši svarīgi karavīru dzīvības uzturēšanai.
1953. gadā Frānsiss Kriks kopā ar Rozalindu Franklinu un Džeimsu Vatsonu noteica DNS struktūru, parādot, ka tā sastāv no divām garām nukleīnskābju nukleotīdu ķēdēm. Šis revolucionārais atklājums pavēra ceļu Meselsonam un Stālam, kuri spēja izstrādāt blīvuma gradienta centrifugēšanas protokolu DNS izolēšanai no E. Coli baktērijām, 1958. gada eksperimentā demonstrējot DNS daļēji konservatīvu replikāciju.
Nukleīnskābju ekstrakcijas metodes
Kādi ir 4 DNS ekstrakcijas posmi?
Visas ekstrakcijas metodes balstās uz vieniem un tiem pašiem pamatdarbības soļiem.
Šūnu darbības traucējumiŠis posms, kas pazīstams arī kā šūnu līze, ietver šūnas sienas un/vai šūnas membrānas noārdīšanu, lai atbrīvotu šūnu šķidrumus, kas satur interesējošās nukleīnskābes.
Nevēlamu gružu noņemšana. Tas ietver membrānas lipīdus, olbaltumvielas un citas nevēlamas nukleīnskābes, kas var traucēt pakārtotajām lietojumprogrammām.
Izolēšana. Ir vairāki dažādi veidi, kā izolēt interesējošās nukleīnskābes no izveidotā attīrītā lizāta, kas iedalās divās galvenajās kategorijās: uz šķīduma bāzes vai cietā stāvoklī (skatiet nākamo sadaļu).
Koncentrācija. Pēc tam, kad nukleīnskābes ir izolētas no visiem pārējiem piesārņotājiem un atšķaidītājiem, tās tiek pasniegtas ļoti koncentrētā eluātā.
Divi ieguves veidi
Pastāv divu veidu nukleīnskābju ekstrakcija – uz šķīdumiem balstītas metodes un cietvielu metodes. Uz šķīdumiem balstīta metode ir pazīstama arī kā ķīmiskā ekstrakcijas metode, jo tā ietver ķīmisku vielu izmantošanu, lai sadalītu šūnu un piekļūtu nukleīnam. To var izdarīt, izmantojot vai nu organiskos savienojumus, piemēram, fenolu un hloroformu, vai mazāk kaitīgos un tāpēc ieteicamākos neorganiskos savienojumus, piemēram, proteināzi K vai silikagelu.
Dažādu ķīmiskās ekstrakcijas metožu piemēri šūnas sadalīšanai ir šādi:
- Osmotiska membrānas plīsums
- Šūnu sienas fermentatīva gremošana
- Membrānas šķīdināšana
- Ar mazgāšanas līdzekļiem
- Ar sārmu apstrādi
Cietfāzes metodes, kas pazīstamas arī kā mehāniskās metodes, ietver DNS mijiedarbības ar cietu substrātu izmantošanu. Izvēloties lodīti vai molekulu, pie kuras DNS saistīsies, bet analīts nepiesaistīsies, ir iespējams atdalīt abas. Cietfāzes ekstrakcijas metožu piemēri, tostarp silīcija dioksīda un magnētisko lodīšu izmantošana.
Magnētisko lodīšu ieguves skaidrojums
Magnētisko lodīšu ekstrakcijas metode
Iespēja iegūt ģenētisko materiālu, izmantojot magnētiskās lodītes, pirmo reizi tika atzīta ASV patentā, ko iesniedza Trevors Hokinss Whitehead institūta pētniecības iestādei. Šajā patentā tika atzīts, ka ģenētisko materiālu ir iespējams iegūt, piesaistot to cietam nesējam, kas varētu būt magnētiskā lodīte. Princips ir tāds, ka tiek izmantota augsti funkcionalizēta magnētiskā lodīte, pie kuras piesaistās ģenētiskais materiāls, ko pēc tam var atdalīt no supernatanta, pieliekot magnētisku spēku trauka, kurā atrodas paraugs, ārpusei.
Kāpēc izmantot magnētisko lodīšu ekstrakciju?
Magnētisko lodīšu ekstrakcijas tehnoloģija kļūst arvien izplatītāka, pateicoties tās potenciālam veikt ātras un efektīvas ekstrakcijas procedūras. Pēdējā laikā ir izstrādātas ļoti funkcionālas magnētiskās lodītes ar piemērotām bufersistēmām, kas ir ļāvušas automatizēt nukleīnskābju ekstrakciju un nodrošināt ļoti resursu ziņā ekonomisku un izmaksu ziņā efektīvu darbplūsmu. Turklāt magnētisko lodīšu ekstrakcijas metodes neietver centrifugēšanas darbības, kas var izraisīt bīdes spēkus, kuri sadala garākus DNS gabalus. Tas nozīmē, ka garākas DNS šķiedras paliek neskartas, kas ir svarīgi genomikas testēšanā.
Publicēšanas laiks: 2022. gada 25. novembris