Įvadas
Kas yra nukleorūgščių ekstrakcija?
Paprasčiausiai tariant, nukleorūgščių ekstrakcija yra RNR ir (arba) DNR pašalinimas iš mėginio ir viso nereikalingo pertekliaus. Ekstrahavimo proceso metu nukleorūgštys iš mėginio išskiriamos ir gaunamos koncentruoto eliuato pavidalu, be skiediklių ir teršalų, kurie galėtų turėti įtakos bet kokiems tolesniems taikymams.
Nukleino rūgščių ekstrakcijos taikymas
Išgrynintos nukleorūgštys naudojamos daugybėje skirtingų sričių, apimančių įvairias pramonės šakas. Sveikatos apsauga yra bene labiausiai naudojama sritis, kurioje jos naudojamos, nes išgryninta RNR ir DNR reikalinga įvairiems tyrimų tikslams.
Nukleino rūgščių ekstrakcijos taikymas sveikatos priežiūros srityje apima:
- Naujos kartos sekvenavimas (NGS)
- Amplifikacijos pagrindu atliekamas SNP genotipų nustatymas
- Masyvų pagrindu atliekamas genotipų nustatymas
- Restrikcinių fermentų virškinimas
- Analizės naudojant modifikuojančius fermentus (pvz., ligavimas ir klonavimas)
Nukleino rūgščių išskyrimas naudojamas ne tik sveikatos priežiūros srityje, bet ir kitose srityse, įskaitant, bet neapsiribojant, tėvystės nustatymą, teismo ekspertizę ir genomiką.
Trumpa nukleorūgščių išgavimo istorija
DNR ekstrakcijaDNR išskyrimas siekia ilgą istoriją, o pirmąjį žinomą išskyrimą 1869 m. atliko šveicarų gydytojas Friedrichas Miescheris. Miescheris tikėjosi išspręsti pagrindinius gyvybės principus, nustatydamas ląstelių cheminę sudėtį. Nesėkmingai ištyrus limfocitus, jam pavyko gauti neapdorotą DNR nuosėdų koncentraciją iš leukocitų, rastų pūliuose ant išmestų tvarsčių. Jis tai padarė į ląstelę įpildamas rūgšties, o po to šarmo, kad paliktų ląstelės citoplazmą, o tada sukūrė protokolą DNR atskyrimui nuo kitų baltymų.
Po novatoriškų Miescherio tyrimų daugelis kitų mokslininkų toliau tobulino ir kūrė DNR išskyrimo ir gryninimo metodus. Baltymų mokslininkas Edwinas Josephas Cohnas Antrojo pasaulinio karo metu sukūrė daug baltymų gryninimo metodų. Jis buvo atsakingas už kraujo plazmos serumo albumino frakcijos, kuri yra svarbi palaikant osmosinį slėgį kraujagyslėse, išskyrimą. Tai buvo labai svarbu, kad kareiviai išliktų gyvi.
1953 m. Francis Crick kartu su Rosalind Franklin ir James Watson nustatė DNR struktūrą, parodydami, kad ją sudaro dvi ilgos nukleorūgščių nukleotidų grandinės. Šis proveržis atvėrė kelią Meselsonui ir Stahliui, kurie sugebėjo sukurti tankio gradiento centrifugavimo protokolą DNR išskyrimui iš E. coli bakterijų, o 1958 m. eksperimento metu jie pademonstravo pusiau konservatyvų DNR replikavimą.
Nukleino rūgšties išskyrimo metodai
Kokie yra 4 DNR išskyrimo etapai?
Visi ekstrahavimo metodai susideda iš tų pačių pagrindinių žingsnių.
Ląstelių sutrikimasŠis etapas, dar žinomas kaip ląstelių lizė, apima ląstelės sienelės ir (arba) ląstelės membranos suardymą, kad būtų išlaisvinti ląstelės skysčiai, kuriuose yra dominančių nukleorūgštys.
Nepageidaujamų šiukšlių pašalinimas. Tai apima membranų lipidus, baltymus ir kitas nepageidaujamas nukleorūgštis, kurios gali trukdyti tolesnėms reikmėms.
Izoliavimas. Yra keletas skirtingų būdų, kaip išskirti dominančias nukleorūgštis iš jūsų sukurto išvalyto lizato, kurie skirstomi į dvi pagrindines kategorijas: tirpalo pagrindu arba kietosios fazės (žr. kitą skyrių).
Koncentracija. Išskyrus nukleorūgštis nuo visų kitų teršalų ir skiediklių, jos pateikiamos labai koncentruotame eliuate.
Du ekstrahavimo tipai
Yra du nukleorūgščių ekstrakcijos tipai – tirpalais pagrįsti metodai ir kietosios fazės metodai. Tirpalais pagrįstas metodas taip pat žinomas kaip cheminės ekstrakcijos metodas, nes jame naudojamos cheminės medžiagos ląstelei suskaidyti ir nukleoinei medžiagai pasiekti. Tai gali būti organiniai junginiai, tokie kaip fenolis ir chloroformas, arba mažiau kenksmingi ir todėl labiau rekomenduojami neorganiniai junginiai, tokie kaip proteinazė K arba silikagelis.
Įvairių cheminių ekstrahavimo metodų, skirtų ląstelėms skaidyti, pavyzdžiai:
- Osmosinis membranos plyšimas
- Ląstelės sienelės fermentinis virškinimas
- Membranos tirpinimas
- Su plovikliais
- Apdorojant šarmais
Kietosios fazės ekstrakcijos metodai, dar vadinami mechaniniais metodais, apima DNR sąveikos su kietuoju substratu išnaudojimą. Pasirinkus granulę arba molekulę, prie kurios prisijungs DNR, bet ne analitas, galima jas atskirti. Kietosios fazės ekstrakcijos metodų pavyzdžiai, įskaitant silicio dioksido ir magnetinių granulių naudojimą.
Magnetinių karoliukų išgavimo paaiškinimas
Magnetinių karoliukų išgavimo metodas
Magnetinių karoliukų panaudojimo potencialas pirmą kartą buvo pripažintas Trevoro Hawkinso pateiktame JAV patente Whitehead instituto tyrimų įstaigai. Šiame patente buvo pripažinta, kad genetinę medžiagą galima išskirti prijungiant ją prie kieto nešiklio, kuris gali būti magnetinis karoliukas. Principas yra tas, kad naudojamas labai funkcionalus magnetinis karoliukas, prie kurio prisijungia genetinė medžiaga, o vėliau ją galima atskirti nuo supernatanto, magnetine jėga veikiant indo, kuriame yra mėginys, išorę.
Kodėl verta naudoti magnetinį karoliukų ištraukimą?
Magnetinių karoliukų išgavimo technologija tampa vis labiau paplitusi dėl jos potencialo greitoms ir efektyvioms išgavimo procedūroms. Pastaruoju metu atsirado daug funkcionalių magnetinių karoliukų su tinkamomis buferinėmis sistemomis, kurios leido automatizuoti nukleorūgščių išgavimą ir sukurti labai mažai išteklių reikalaujantį bei ekonomišką darbo eigą. Be to, magnetinių karoliukų išgavimo metoduose nereikia centrifugavimo etapų, kurie gali sukelti šlyties jėgas, ardančias ilgesnes DNR dalis. Tai reiškia, kad ilgesnės DNR grandinės lieka nepažeistos, o tai svarbu atliekant genomikos tyrimus.
Įrašo laikas: 2022 m. lapkričio 25 d.