מיצוי חומצות גרעין ושיטת החרוזים המגנטיים

מָבוֹא

מהי מיצוי חומצות גרעין?

במילים פשוטות ביותר, מיצוי חומצות גרעין הוא הסרת ה-RNA ו/או ה-DNA מדגימה וכל העודף שאינו הכרחי. תהליך המיצוי מבודד את חומצות הגרעין מהדגימה ומניב אותן בצורת תמיסת אלואיד מרוכזת, נקייה ממדללנים ומזהמים שעלולים להשפיע על כל יישומים בהמשך.

יישומים של מיצוי חומצות גרעין

חומצות גרעין מטוהרות משמשות במגוון רחב של יישומים, הנעים על פני תעשיות שונות. תחום הבריאות הוא אולי התחום בו הן נמצאות בשימוש הרב ביותר, כאשר RNA ו-DNA מטוהרים נדרשים למגוון רחב של מטרות בדיקה.

יישומים של מיצוי חומצות גרעין בתחום הבריאות כוללים:

- הגברת PCR ו-qPCR

- ריצוף הדור הבא (NGS)

- גנוטיפיזציה של SNP מבוססת הגברה

- גנוטיפינג מבוסס מערך

- עיכול אנזימי הגבלה

- אנליזות באמצעות אנזימים משנים (למשל קשירה ושיבוט)

ישנם גם תחומים אחרים מעבר לתחום הבריאות בהם נעשה שימוש בחילוץ חומצות גרעין, כולל אך לא רק בדיקות אבהות, זיהוי פלילי וגנומיקה.

היסטוריה קצרה של מיצוי חומצות גרעין

מיצוי DNAמחקר זה מתוארך לפני זמן רב, כאשר הבידוד הידוע הראשון בוצע על ידי רופא שוויצרי בשם פרידריך מישר בשנת 1869. מישר קיווה לפתור את עקרונות החיים הבסיסיים על ידי קביעת ההרכב הכימי של תאים. לאחר שנכשל עם לימפוציטים, הוא הצליח להשיג משקע גולמי של DNA מלקוציטים שנמצאו במוגלה על תחבושות שהושלכו. הוא עשה זאת על ידי הוספת חומצה ולאחר מכן בסיס לתא כדי להשאיר את הציטופלזמה של התא, ולאחר מכן פיתח פרוטוקול להפרדת ה-DNA משאר החלבונים.

בעקבות מחקרו פורץ הדרך של מישר, מדענים רבים אחרים המשיכו לפתח טכניקות לבידוד וטיהור DNA. אדווין ג'וזף כהן, מדען חלבונים, פיתח טכניקות רבות לטיהור חלבונים במהלך מלחמת העולם השנייה. הוא היה אחראי על בידוד חלק האלבומין בסרום של פלזמת הדם, שהוא חשוב לשמירה על לחץ אוסמוטי בכלי הדם. זה היה קריטי לשמירה על חייהם של חיילים.

בשנת 1953, פרנסיס קריק, יחד עם רוזלינד פרנקלין וג'יימס ווטסון, קבעו את מבנה ה-DNA, והראו שהוא מורכב משני גדילים של שרשראות ארוכות של נוקלאוטידים של חומצות גרעין. תגלית פורצת דרך זו סללה את הדרך עבור מסלסון ושטאהל, שהצליחו לפתח פרוטוקול צנטריפוגה בצפיפות כדי לבודד DNA מחיידקי E. coli, כאשר הם הדגימו את השכפול החצי-שמרני של DNA במהלך הניסוי שלהם בשנת 1958.

טכניקות של מיצוי חומצות גרעין

מהם 4 השלבים של מיצוי DNA?
כל שיטות החילוץ מסתכמות באותם שלבים בסיסיים.

שיבוש תאיםשלב זה, המכונה גם ליזיס תאים, כרוך בפירוק דופן התא ו/או קרום התא, על מנת לשחרר את הנוזלים התוך-תאיים המכילים את חומצות הגרעין הרצויות.

הסרת פסולת לא רצויה. זה כולל ליפידים בממברנה, חלבונים וחומצות גרעין לא רצויות אחרות אשר עלולות להפריע ליישומים בהמשך.

בידוד. ישנן מספר דרכים שונות לבודד את חומצות הגרעין הרלוונטיות מהליזט המטוהר שיצרתם, אשר מתחלקות בין שתי קטגוריות עיקריות: מבוססות תמיסה או במצב מוצק (ראו סעיף הבא).

ריכוז. לאחר שבודדו חומצות הגרעין מכל שאר המזהמים והמדללים, הן מוצגות בתמיסה מרוכזת ביותר.

שני סוגי החילוץ
ישנם שני סוגים של מיצוי חומצות גרעין - שיטות מבוססות תמיסה ושיטות במצב מוצק. השיטה מבוססת התמיסה ידועה גם כשיטת מיצוי כימית, מכיוון שהיא כוללת שימוש בכימיקלים לפירוק התא ולגישה לחומר הגרעיני. ניתן להשתמש בתרכובות אורגניות כגון פנול וכלורופורם, או בתרכובות אנאורגניות פחות מזיקות ולכן מומלצות יותר כגון פרוטאינאז K או סיליקה ג'ל.

דוגמאות לשיטות מיצוי כימיות שונות לפירוק תא כוללות:

- קרע אוסמוטי של הממברנה

- עיכול אנזימטי של דופן התא

- מסיסות של הממברנה

- עם חומרי ניקוי

- עם טיפול אלקלי

טכניקות מצב מוצק, הידועות גם כשיטות מכניות, כוללות ניצול האופן שבו DNA מקיים אינטראקציה עם מצע מוצק. על ידי בחירת חרוז או מולקולה שאליהם ה-DNA ייקשר אך האנליט לא, ניתן להפריד בין השניים. דוגמאות לטכניקות מיצוי בפאזה מוצקה כוללות שימוש בסיליקה ובחרוזים מגנטיים.

הסבר על חילוץ חרוזים מגנטיים

שיטת החילוץ של חרוזים מגנטיים
הפוטנציאל לחילוץ באמצעות חרוזים מגנטיים זוהה לראשונה בפטנט אמריקאי שהוגש על ידי טרבור הוקינס, עבור מכון המחקר וייטהד. פטנט זה הכיר בכך שניתן לחלץ חומר גנטי על ידי קשירתו לנשא תמיכה מוצק, שיכול להיות חרוז מגנטי. העיקרון הוא שמשתמשים בחרוז מגנטי בעל פונקציונליות גבוהה שאליו ייקשר החומר הגנטי, אשר לאחר מכן ניתן להפרידו מהנוזל העל-תכליתי על ידי הפעלת כוח מגנטי על החלק החיצוני של הכלי המכיל את הדגימה.

למה להשתמש בחילוץ חרוזים מגנטיים?
טכנולוגיית מיצוי חרוזים מגנטיים הופכת נפוצה יותר ויותר, בשל הפוטנציאל הטמון בה להליכי מיצוי מהירים ויעילים. לאחרונה חלו פיתוחים של חרוזים מגנטיים בעלי פונקציונליות גבוהה עם מערכות בופר מתאימות, אשר אפשרו אוטומציה של מיצוי חומצות גרעין ותהליך עבודה דל משאבים וחסכוני מאוד. כמו כן, שיטות מיצוי חרוזים מגנטיים אינן כרוכות בשלבי צנטריפוגה שיכולים לגרום לכוחות גזירה אשר שוברים פיסות DNA ארוכות יותר. משמעות הדבר היא שגדילי DNA ארוכים יותר נשארים שלמים, דבר שחשוב בבדיקות גנומיקה.