Bevezetés
Mi a nukleinsav-kivonás?
A legegyszerűbben fogalmazva, a nukleinsav-extrakció az RNS és/vagy DNS eltávolítása a mintából, valamint az összes felesleges rész eltávolítása. Az extrakció során a nukleinsavakat izolálják a mintából, és koncentrált eluátum formájában nyerik ki azokat, mentesen a hígítószerektől és a szennyeződésektől, amelyek befolyásolhatnák a további alkalmazásokat.
A nukleinsav-extrakció alkalmazásai
A tisztított nukleinsavakat számos különböző alkalmazásban használják, számos különböző iparágban. Az egészségügy talán az a terület, ahol a legtöbbet használják, ahol a tisztított RNS-re és DNS-re számos különböző vizsgálati célra van szükség.
A nukleinsav-extrakció egészségügyi alkalmazásai a következők:
- Következő generációs szekvenálás (NGS)
- Amplifikáción alapuló SNP genotípus-meghatározás
- Tömbalapú genotípus-meghatározás
- Restrikciós enzimes emésztés
- Módosító enzimeket alkalmazó elemzések (pl. ligálás és klónozás)
Az egészségügyön túl más területeken is alkalmazzák a nukleinsav-kivonást, beleértve többek között az apasági tesztet, a forenzikát és a genomikát.
A nukleinsav-kivonás rövid története
DNS-kivonásA DNS izolálásának története hosszú múltra tekint vissza, az első ismert izolálást egy svájci orvos, Friedrich Miescher végezte 1869-ben. Miescher az élet alapelveinek megoldását remélte a sejtek kémiai összetételének meghatározásával. Miután a limfocitákkal nem járt sikerrel, sikerült nyers DNS-csapadékot nyernie az eldobott kötszerek gennyében talált leukocitákból. Ezt úgy érte el, hogy savat, majd lúgot adott a sejthez, hogy elhagyja a sejt citoplazmáját, majd kidolgozott egy protokollt a DNS elválasztására a többi fehérjétől.
Miescher úttörő kutatásait követően számos más tudós fejlesztette ki a DNS izolálására és tisztítására szolgáló technikákat. Edwin Joseph Cohn fehérjekutató számos fehérjetisztítási technikát fejlesztett ki a második világháború alatt. Ő volt felelős a vérplazma szérumalbumin-frakciójának izolálásáért, amely fontos az ozmotikus nyomás fenntartásában az erekben. Ez kulcsfontosságú volt a katonák életben maradása szempontjából.
1953-ban Francis Crick Rosalind Franklinnel és James Watsonnal együtt meghatározta a DNS szerkezetét, kimutatva, hogy az két hosszú nukleinsav-nukleotidláncból áll. Ez az áttörést jelentő felfedezés utat nyitott Meselson és Stahl számára, akik képesek voltak kidolgozni egy sűrűséggradiens centrifugálási protokollt a DNS izolálására E. coli baktériumokból, miközben 1958-as kísérletük során bemutatták a DNS félkonzervatív replikációját.
Nukleinsav-kivonási technikák
Melyek a DNS-kivonás 4 szakasza?
Minden extrakciós módszer ugyanazokra az alapvető lépésekre vezethető vissza.
SejtkárosodásEz a szakasz, más néven sejtlízis, magában foglalja a sejtfal és/vagy a sejtmembrán lebontását, hogy felszabadítsa a kérdéses nukleinsavakat tartalmazó sejten belüli folyadékokat.
Nemkívánatos törmelék eltávolítása. Ide tartoznak a membránlipidek, fehérjék és más nemkívánatos nukleinsavak, amelyek zavarhatják a további alkalmazásokat.
Izolálás. Számos különböző módja van a kívánt nukleinsavak izolálásának a létrehozott tisztított lizátumból, amelyek két fő kategóriába sorolhatók: oldat alapú vagy szilárd fázisú (lásd a következő szakaszt).
Koncentráció. Miután a nukleinsavakat minden más szennyeződéstől és hígítószertől izolálták, egy nagy koncentrációjú eluátumban kerülnek bemutatásra.
A kétféle extrakció
A nukleinsav-extrakciónak két típusa van – az oldatalapú módszerek és a szilárd fázisú módszerek. Az oldatalapú módszert kémiai extrakciós módszernek is nevezik, mivel vegyszerek használatával bontják le a sejtet és férnek hozzá a nukleinsav anyagához. Ez történhet szerves vegyületekkel, például fenollal és kloroformmal, vagy kevésbé káros és ezért ajánlottabb szervetlen vegyületekkel, például proteináz K-val vagy szilikagéllel.
A sejtek lebontására szolgáló különböző kémiai extrakciós módszerek példái a következők:
- Ozmotikus membránrepedés
- A sejtfal enzimes emésztése
- A membrán oldódása
- Mosószerekkel
- Lúgos kezeléssel
A szilárd fázisú technikák, más néven mechanikai módszerek, a DNS és a szilárd szubsztrát kölcsönhatásának kiaknázását foglalják magukban. Egy olyan gyöngy vagy molekula kiválasztásával, amelyhez a DNS kötődik, de az analit nem, lehetővé válik a kettő elválasztása. A szilárd fázisú extrakciós technikákra példaként említhető a szilícium-dioxid és a mágneses gyöngyök használata.
Mágneses gyöngykivonás magyarázata
A mágneses gyöngykivonási módszer
A mágneses gyöngyökkel történő extrakció lehetőségét először Trevor Hawkins által a Whitehead Intézet kutatóintézete számára benyújtott amerikai szabadalomban ismerték fel. Ez a szabadalom elismerte, hogy genetikai anyag kinyerése lehetséges egy szilárd hordozóhoz, például egy mágneses gyöngyhöz kötve. Az elv az, hogy egy nagymértékben funkcionalizált mágneses gyöngyöt használnak, amelyhez a genetikai anyag kötődik, majd a mintát tartalmazó edény külsejére mágneses erő alkalmazásával elválasztható a felülúszótól.
Miért érdemes mágneses gyöngykivonást használni?
A mágneses gyöngyös extrakciós technológia egyre elterjedtebbé válik a gyors és hatékony extrakciós eljárásokban rejlő potenciál miatt. Az utóbbi időben megjelentek a megfelelő pufferrendszerekkel ellátott, magas funkcionalitású mágneses gyöngyök, amelyek lehetővé tették a nukleinsav-extrakció automatizálását, valamint egy nagyon erőforrás- és költséghatékony munkafolyamatot. A mágneses gyöngyös extrakciós módszerek emellett nem tartalmazzák a centrifugálási lépéseket, amelyek nyíróerőket okozhatnának, amelyek a hosszabb DNS-darabokat szétszakítanák. Ez azt jelenti, hogy a hosszabb DNS-szálak érintetlenek maradnak, ami fontos a genomikai tesztelésben.
Közzététel ideje: 2022. november 25.