Uvod
Što je ekstrakcija nukleinskih kiselina?
Najjednostavnije rečeno, ekstrakcija nukleinske kiseline je uklanjanje RNA i/ili DNA iz uzorka i sveg nepotrebnog viška. Proces ekstrakcije izolira nukleinske kiseline iz uzorka i daje ih u obliku koncentriranog eluata, bez razrjeđivača i onečišćujućih tvari koje bi mogle utjecati na bilo koju daljnju primjenu.
Primjena ekstrakcije nukleinskih kiselina
Pročišćene nukleinske kiseline koriste se u mnoštvu različitih primjena, u raznim industrijama. Zdravstvo je možda područje gdje se najviše koriste, a pročišćena RNA i DNA potrebne su za niz različitih testiranja.
Primjene ekstrakcije nukleinskih kiselina u zdravstvu uključuju:
- Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS)
- SNP genotipizacija temeljena na amplifikaciji
- Genotipizacija temeljena na nizovima
- Digestija restrikcijskim enzimima
- Analize korištenjem modificirajućih enzima (npr. ligacija i kloniranje)
Postoje i druga područja izvan zdravstva gdje se koristi ekstrakcija nukleinskih kiselina, uključujući, ali ne ograničavajući se na testiranje očinstva, forenziku i genomiku.
Kratka povijest ekstrakcije nukleinskih kiselina
Ekstrakcija DNKdatira daleko u prošlost, a prvu poznatu izolaciju izveo je švicarski liječnik Friedrich Miescher 1869. godine. Miescher se nadao riješiti temeljne principe života određivanjem kemijskog sastava stanica. Nakon neuspjeha s limfocitima, uspio je dobiti sirovi talog DNK iz leukocita pronađenih u gnoju na odbačenim zavojima. To je učinio dodavanjem kiseline, a zatim lužine stanici kako bi napustio citoplazmu stanice, a zatim je razvio protokol za odvajanje DNK od ostalih proteina.
Nakon Miescherovog revolucionarnog istraživanja, mnogi drugi znanstvenici su unaprijedili i razvili tehnike za izolaciju i pročišćavanje DNK. Edwin Joseph Cohn, znanstvenik za proteine, razvio je mnoge tehnike za pročišćavanje proteina tijekom Drugog svjetskog rata. Bio je odgovoran za izolaciju frakcije serumskog albumina u krvnoj plazmi, koja je važna za održavanje osmotskog tlaka u krvnim žilama. To je bilo ključno za održavanje života vojnika.
Godine 1953. Francis Crick je, zajedno s Rosalind Franklin i Jamesom Watsonom, odredio strukturu DNK, pokazujući da se sastoji od dva lanca dugih lanaca nukleinskih kiselina i nukleotida. Ovo revolucionarno otkriće utrlo je put Meselsonu i Stahlu, koji su uspjeli razviti protokol centrifugiranja u gradijentu gustoće za izolaciju DNK iz bakterije E. coli, demonstrirajući polukonzervativnu replikaciju DNK tijekom svog eksperimenta 1958. godine.
Tehnike ekstrakcije nukleinskih kiselina
Koje su 4 faze ekstrakcije DNK?
Sve metode ekstrakcije svode se na iste temeljne korake.
Poremećaj stanicaOva faza, poznata i kao stanična liza, uključuje razgradnju stanične stijenke i/ili stanične membrane kako bi se oslobodile intracelularne tekućine koje sadrže nukleinske kiseline od interesa.
Uklanjanje neželjenih ostataka. To uključuje membranske lipide, proteine i druge neželjene nukleinske kiseline koje mogu ometati daljnje primjene.
Izolacija. Postoji niz različitih načina za izolaciju nukleinskih kiselina od interesa iz pročišćenog lizata koji ste stvorili, a koji spadaju u dvije glavne kategorije: na bazi otopine ili u čvrstom stanju (vidi sljedeći odjeljak).
Koncentracija. Nakon što su nukleinske kiseline izolirane od svih ostalih onečišćujućih tvari i razrjeđivača, one se prezentiraju u visoko koncentriranom eluatu.
Dvije vrste ekstrakcije
Postoje dvije vrste ekstrakcije nukleinskih kiselina - metode temeljene na otopini i metode u čvrstom stanju. Metoda temeljena na otopini poznata je i kao metoda kemijske ekstrakcije, jer uključuje korištenje kemikalija za razgradnju stanice i pristup nukleinskom materijalu. To se može učiniti korištenjem organskih spojeva poput fenola i kloroforma ili manje štetnih i stoga preporučenijih anorganskih spojeva poput proteinaze K ili silikagela.
Primjeri različitih metoda kemijske ekstrakcije za razgradnju stanice uključuju:
- Osmotsko pucanje membrane
- Enzimska razgradnja stanične stijenke
- Solubilizacija membrane
- S deterdžentima
- S alkalnom obradom
Tehnike čvrstog stanja, poznate i kao mehaničke metode, uključuju iskorištavanje načina na koji DNK interagira s čvrstom podlogom. Odabirom kuglice ili molekule na koju će se DNK vezati, ali analit neće, moguće je odvojiti to dvoje. Primjeri tehnika ekstrakcije u čvrstoj fazi uključuju korištenje silicijevog dioksida i magnetskih kuglica.
Objašnjenje ekstrakcije magnetskih kuglica
Metoda ekstrakcije magnetskim kuglicama
Potencijal za ekstrakciju pomoću magnetskih kuglica prvi je put prepoznat u američkom patentu koji je podnio Trevor Hawkins za istraživačku instituciju Whitehead Institute. Ovaj je patent priznao da je moguće ekstrahirati genetski materijal vezanjem na čvrsti nosač, koji može biti magnetska kuglica. Princip je da se koristi visoko funkcionalizirana magnetska kuglica na koju će se vezati genetski materijal, koji se zatim može odvojiti od supernatanta primjenom magnetske sile na vanjsku stranu posude koja drži uzorak.
Zašto koristiti ekstrakciju magnetskih kuglica?
Tehnologija ekstrakcije magnetskim kuglicama postaje sve raširenija zbog potencijala koji ima za brze i učinkovite postupke ekstrakcije. U novije vrijeme razvijene su visoko funkcionalizirane magnetske kuglice s prikladnim puferskim sustavima, što je omogućilo automatizaciju ekstrakcije nukleinskih kiselina i tijek rada koji je vrlo jednostavan i isplativ u pogledu resursa. Također, metode ekstrakcije magnetskim kuglicama ne uključuju korake centrifugiranja koji mogu uzrokovati sile smicanja koje razbijaju dulje dijelove DNK. To znači da dulji lanci DNK ostaju netaknuti, što je važno u genomskom testiranju.
Vrijeme objave: 25. studenog 2022.