न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और चुंबकीय मनका विधि

परिचय

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण क्या है?

सरल शब्दों में कहें तो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में नमूने से आरएनए और/या डीएनए को हटाना और वह सब अतिरिक्त निकालना शामिल है जो आवश्यक नहीं है। निष्कर्षण की प्रक्रिया में नमूने से न्यूक्लिक एसिड को अलग किया जाता है और उन्हें एक केंद्रित एलुएट के रूप में प्राप्त किया जाता है, जो किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को प्रभावित करने वाले तनुकारक और संदूषक से मुक्त होता है।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोग

शुद्ध न्यूक्लिक एसिड का उपयोग कई अलग-अलग उद्योगों में कई तरह के अनुप्रयोगों में किया जाता है। स्वास्थ्य सेवा शायद वह क्षेत्र है जहाँ इसका सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, जहाँ विभिन्न परीक्षण उद्देश्यों के लिए शुद्ध आरएनए और डीएनए की आवश्यकता होती है।

स्वास्थ्य देखभाल में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के अनुप्रयोगों में शामिल हैं:

- पीसीआर और क्यूपीसीआर प्रवर्धन

- अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस)

- प्रवर्धन-आधारित एसएनपी जीनोटाइपिंग

- सरणी-आधारित जीनोटाइपिंग

- प्रतिबंध एंजाइम पाचन

- संशोधित एंजाइमों का उपयोग करके विश्लेषण (जैसे लिगेशन और क्लोनिंग)

स्वास्थ्य देखभाल के अलावा अन्य क्षेत्र भी हैं जहां न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का उपयोग किया जाता है, जिसमें पितृत्व परीक्षण, फोरेंसिक और जीनोमिक्स शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं है।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का संक्षिप्त इतिहास

डीएनए निष्कर्षणबहुत पहले की बात है, पहला ज्ञात पृथक्करण 1869 में फ्रेडरिक मीशर नामक स्विस चिकित्सक द्वारा किया गया था। मीशर कोशिकाओं की रासायनिक संरचना का निर्धारण करके जीवन के मूल सिद्धांतों को हल करने की उम्मीद कर रहे थे। लिम्फोसाइट्स के साथ असफल होने के बाद, वह त्यागे गए पट्टियों पर मवाद में पाए जाने वाले ल्यूकोसाइट्स से डीएनए का एक कच्चा अवक्षेप प्राप्त करने में सक्षम था। उन्होंने कोशिका के कोशिकाद्रव्य को छोड़ने के लिए कोशिका में एसिड और फिर क्षार डालकर ऐसा किया, और फिर डीएनए को अन्य प्रोटीन से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया।

मीशर के अभूतपूर्व शोध के बाद, कई अन्य वैज्ञानिकों ने डीएनए को अलग करने और शुद्ध करने की तकनीक विकसित की है। एडविन जोसेफ कोहन, एक प्रोटीन वैज्ञानिक ने द्वितीय विश्व युद्ध के दौरान प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए कई तकनीकें विकसित कीं। वह रक्त प्लाज्मा के सीरम एल्ब्यूमिन अंश को अलग करने के लिए जिम्मेदार थे, जो रक्त वाहिकाओं में आसमाटिक दबाव बनाए रखने में महत्वपूर्ण है। सैनिकों को जीवित रखने के लिए यह महत्वपूर्ण था।

1953 में फ्रांसिस क्रिक ने रोजालिंड फ्रैंकलिन और जेम्स वॉटसन के साथ मिलकर डीएनए की संरचना निर्धारित की, जिसमें दिखाया गया कि यह न्यूक्लिक एसिड न्यूक्लियोटाइड की लंबी श्रृंखलाओं के दो स्ट्रैंड से बना है। इस महत्वपूर्ण खोज ने मेसेलसन और स्टाहल के लिए मार्ग प्रशस्त किया, जो ई. कोली बैक्टीरिया से डीएनए को अलग करने के लिए घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे क्योंकि उन्होंने अपने 1958 के प्रयोग के दौरान डीएनए की अर्ध-रूढ़िवादी प्रतिकृति का प्रदर्शन किया था।

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की तकनीकें

डीएनए निष्कर्षण के 4 चरण क्या हैं?
सभी निष्कर्षण विधियां एक ही मूलभूत चरण पर आधारित हैं।

कोशिका विघटनइस चरण को कोशिका अपघटन के नाम से भी जाना जाता है, जिसमें कोशिका भित्ति और/या कोशिका झिल्ली को तोड़ा जाता है, ताकि आवश्यक न्यूक्लिक अम्लों से युक्त अंतर-कोशिकीय तरल पदार्थ मुक्त हो सकें।

अवांछित मलबे को हटाना। इसमें झिल्ली लिपिड, प्रोटीन और अन्य अवांछित न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में बाधा डाल सकते हैं।

पृथक्करण। आपके द्वारा बनाए गए स्वच्छ लाइसेट से इच्छित न्यूक्लिक अम्लों को पृथक करने के कई अलग-अलग तरीके हैं, जो दो मुख्य श्रेणियों में आते हैं: विलयन आधारित या ठोस अवस्था (अगला भाग देखें)।

सान्द्रण: न्यूक्लिक अम्लों को अन्य सभी संदूषकों और तनुकों से पृथक करने के बाद, उन्हें अत्यधिक सान्द्रित एलुएट में प्रस्तुत किया जाता है।

निष्कर्षण के दो प्रकार
न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के दो प्रकार हैं - समाधान आधारित विधियाँ और ठोस अवस्था विधियाँ। समाधान आधारित विधि को रासायनिक निष्कर्षण विधि के रूप में भी जाना जाता है, क्योंकि इसमें कोशिका को तोड़ने और न्यूक्लिक सामग्री तक पहुँचने के लिए रसायनों का उपयोग करना शामिल है। इसमें या तो फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे कार्बनिक यौगिकों का उपयोग किया जा सकता है, या कम हानिकारक और इसलिए अधिक अनुशंसित अकार्बनिक यौगिकों जैसे प्रोटीनेज के या सिलिका जेल का उपयोग किया जा सकता है।

किसी कोशिका को तोड़ने के लिए विभिन्न रासायनिक निष्कर्षण विधियों के उदाहरणों में शामिल हैं:

- झिल्ली का आसमाटिक टूटना

- कोशिका भित्ति का एंजाइमेटिक पाचन

- झिल्ली का घुलनशीलता

- डिटर्जेंट के साथ

- क्षार उपचार के साथ

ठोस अवस्था तकनीक, जिसे यांत्रिक विधियाँ भी कहा जाता है, में यह पता लगाना शामिल है कि डीएनए ठोस सब्सट्रेट के साथ कैसे संपर्क करता है। एक मनका या अणु का चयन करके जिससे डीएनए बंधेगा लेकिन विश्लेषक नहीं, दोनों को अलग करना संभव है। सिलिका और चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने सहित ठोस-चरण निष्कर्षण तकनीकों के उदाहरण।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण समझाया गया

चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधि
चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके निष्कर्षण की संभावना को पहली बार व्हाइटहेड इंस्टीट्यूट अनुसंधान संस्थान के लिए ट्रेवर हॉकिन्स द्वारा दायर एक अमेरिकी पेटेंट में पहचाना गया था। इस पेटेंट ने स्वीकार किया कि आनुवंशिक सामग्री को एक ठोस सहायक वाहक से बांधकर निकालना संभव था, जो एक चुंबकीय मनका हो सकता है। सिद्धांत यह है कि आप एक अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मनका का उपयोग करते हैं जिस पर आनुवंशिक सामग्री बंध जाएगी, जिसे फिर नमूने को पकड़े हुए बर्तन के बाहर चुंबकीय बल लगाकर सतह पर तैरने वाले पदार्थ से अलग किया जा सकता है।

चुंबकीय मनका निष्कर्षण का उपयोग क्यों करें?
चुंबकीय मनका निष्कर्षण तकनीक तेजी से प्रचलित हो रही है, क्योंकि इसमें तेजी से और कुशल निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए क्षमता है। हाल के दिनों में उपयुक्त बफर सिस्टम के साथ अत्यधिक कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का विकास हुआ है, जिसने न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के स्वचालन और एक कार्यप्रवाह को संभव बनाया है जो बहुत ही संसाधन हल्का और लागत-कुशल है। इसके अलावा, चुंबकीय मनका निष्कर्षण विधियों में सेंट्रीफ्यूजेशन चरण शामिल नहीं होते हैं जो कतरनी बलों का कारण बन सकते हैं जो डीएनए के लंबे टुकड़ों को तोड़ देते हैं। इसका मतलब है कि डीएनए के लंबे स्ट्रैंड बरकरार रहते हैं, जो जीनोमिक्स परीक्षण में महत्वपूर्ण है।