Ynlieding
Wat is nukleïnezuurekstraksje?
Yn 'e ienfâldichste termen is nukleïnezuurekstraksje it fuortheljen fan it RNA en/of DNA út in stekproef en alle oerstallige stof dy't net nedich is. It proses fan ekstraksje isolearret de nukleïnesoeren út in stekproef en jout se yn 'e foarm fan in konsintrearre eluaat, frij fan ferdunningsmiddels en fersmoarging dy't ynfloed kinne hawwe op alle downstream-tapassingen.
Tapassingen fan nukleïnezuurekstraksje
Suvere nukleïnesoeren wurde brûkt yn in oerfloed fan ferskillende tapassingen, fariearjend yn meardere ferskillende yndustryen. Sûnenssoarch is miskien it gebiet wêr't it it meast brûkt wurdt, mei suvere RNA en DNA dy't nedich binne foar in protte ferskillende testdoelen.
Tapassingen fan nukleïnezuurekstraksje yn sûnenssoarch omfetsje:
- Folgjende Generaasje Sekwinsje (NGS)
- Amplifikaasje-basearre SNP-genotyping
- Array-basearre genotyping
- Restriksje-enzymfertarring
- Analysen mei modifisearjende enzymen (bygelyks ligaasje en kloning)
Der binne ek oare fjilden bûten de sûnenssoarch wêr't nukleïnezuurekstraksje brûkt wurdt, ynklusyf mar net beheind ta heiteskipstests, forensysk ûndersyk en genomika.
In koarte skiednis fan nukleïnezuurwinning
DNA-ekstraksjedatearret in lange wei werom, mei de earste bekende isolaasje dy't útfierd waard troch in Switserske dokter mei de namme Friedrich Miescher yn 1869. Miescher hope de fûnemintele prinsipes fan it libben op te lossen troch de gemyske gearstalling fan sellen te bepalen. Nei't er mislearre wie mei lymfocyten, koe er in rûge delslach fan DNA krije fan leukocyten dy't fûn waarden yn pus op fuortsmiten ferbannen. Hy die dit troch soer en dan alkali ta te foegjen oan 'e sel om it cytoplasma fan' e sel te ferlitten, en ûntwikkele doe in protokol om it DNA te skieden fan 'e oare proteïnen.
Nei it baanbrekkende ûndersyk fan Miescher binne in protte oare wittenskippers trochgien mei it ûntwikkeljen fan techniken om DNA te isolearjen en te suverjen. Edwin Joseph Cohn, in proteïnewittenskipper, ûntwikkele in protte techniken foar proteïne-suvering tidens de Twadde Wrâldoarloch. Hy wie ferantwurdlik foar it isolearjen fan de serumalbuminefraksje fan bloedplasma, dy't wichtich is foar it behâld fan de osmotyske druk yn 'e bloedfetten. Dit wie krúsjaal foar it yn libben hâlden fan soldaten.
Yn 1953 bepaalde Francis Crick, tegearre mei Rosalind Franklin en James Watson, de struktuer fan DNA, en liet sjen dat it opboud wie út twa stringen fan lange keatlingen fan nukleïnezuurnukleotiden. Dizze trochbraakûntdekking makke de wei frij foar Meselson en Stahl, dy't in tichtheidsgradiënt-sintrifugaasjeprotokol ûntwikkelje koene om DNA te isolearjen fan E. coli-baktearjes, om't se de semi-konservative replikaasje fan DNA demonstrearren tidens har eksperimint yn 1958.
Techniken fan nukleïnezuurekstraksje
Wat binne de 4 stadia fan DNA-ekstraksje?
Alle ekstraksjemetoaden komme del op deselde fûnemintele stappen.
SelfersteuringDizze faze, ek wol bekend as sellysis, omfettet it ôfbrekken fan 'e selwand en/of it selmembraan, om de intrasellulêre floeistoffen frij te meitsjen dy't de nukleïnesoeren fan belang befetsje.
Ferwidering fan net winske pún. Dit omfettet membraanlipiden, aaiwiten en oare net winske nukleïnesoeren dy't downstream-tapassingen kinne bemuoie.
Isolaasje. Der binne in oantal ferskillende manieren om de nukleïnesoeren fan belang te isolearjen fan it skjinmakke lysaat dat jo makke hawwe, dy't tusken twa haadkategoryen falle: oplossingsbasearre of fêste tastân (sjoch folgjende seksje).
Konsintraasje. Nei't de nukleïnesoeren isolearre binne fan alle oare fersmoargjende stoffen en ferdunningsmiddels, wurde se presintearre yn in heechkonsintrearre eluaat.
De twa soarten ekstraksje
Der binne twa soarten nukleïnezuurekstraksje - oplossingsbasearre metoaden en fêste-tastânmetoaden. De oplossingsbasearre metoade is ek wol bekend as de gemyske ekstraksjemetoade, om't it giet om it brûken fan gemikaliën om de sel ôf te brekken en tagong te krijen ta it nukleïnemateriaal. Dit kin gebrûk meitsje fan organyske ferbiningen lykas fenol en chloroform, of de minder skealike en dêrom mear oanrikkemandearre anorganyske ferbiningen lykas Proteinase K of silikagel.
Foarbylden fan ferskate gemyske ekstraksjemetoaden om in sel ôf te brekken binne:
- Osmotyske brekking fan it membraan
- Enzymatyske spiisfertarring fan selwand
- Oplosberens fan membraan
- Mei waskmiddels
- Mei alkalibehanneling
Fêste-faze-techniken, ek wol bekend as meganyske metoaden, omfetsje it eksploitearjen fan hoe't DNA ynteraksje hat mei in fêst substraat. Troch in kraal of molekule te selektearjen dêr't it DNA oan bine sil, mar de analyte net, is it mooglik om de twa te skieden. Foarbylden fan fêste-faze-ekstraksjetechniken omfetsje it brûken fan silika en magnetyske kralen.
Magnetyske kralenekstraksje útlein
De metoade foar it ekstrahearjen fan magnetyske kralen
De mooglikheid foar ekstraksje mei magnetyske kralen waard earst erkend yn in Amerikaansk oktroai yntsjinne troch Trevor Hawkins, foar it ûndersyksynstitút Whitehead Institute. Dit oktroai erkende dat it mooglik wie om genetysk materiaal te ekstrahearjen troch it te binen oan in fêste drager, dy't in magnetyske kraal wêze koe. It prinsipe is dat jo in heechfunksjonalisearre magnetyske kraal brûke wêr't it genetyske materiaal oan bindt, dy't dan skieden wurde kin fan it supernatant troch in magnetyske krêft ta te passen op 'e bûtenkant fan it fet dat it stekproef befettet.
Wêrom magnetyske kralenekstraksje brûke?
Magnetyske kralen-ekstraksjetechnology wurdt hieltyd faker brûkt, fanwegen it potinsjeel dat it hat foar rappe en effisjinte ekstraksjeprosedueres. Yn 'e lêste tiid binne der ûntwikkelingen west fan heechfunksjonalisearre magnetyske kralen mei geskikte buffersystemen, dy't automatisearring fan nukleïnezuur-ekstraksje mooglik makke hawwe en in workflow dy't tige boarnenleas en kosten-effisjint is. Ek omfetsje metoaden foar magnetyske kralen-ekstraksje net de sintrifugaasjestappen dy't skuorkrêften kinne feroarsaakje dy't langere stikken DNA brekke. Dit betsjut dat langere DNA-strengen yntakt bliuwe, wat wichtich is by genomika-testen.
Pleatsingstiid: 25 novimber 2022