Johdanto
Mikä on nukleiinihappojen uuttaminen?
Yksinkertaisimmillaan nukleiinihappojen uuttaminen on RNA:n ja/tai DNA:n sekä kaiken ylimääräisen tarpeettoman poistamista näytteestä. Uuttoprosessissa nukleiinihapot eristetään näytteestä ja saadaan ne väkevöitynä eluaattina, joka ei sisällä laimennusaineita tai epäpuhtauksia, jotka voisivat vaikuttaa jatkosovelluksiin.
Nukleiinihappojen uuttamisen sovellukset
Puhdistettuja nukleiinihappoja käytetään lukuisissa eri sovelluksissa useilla eri toimialoilla. Terveydenhuolto on kenties alue, jolla sitä käytetään eniten, ja puhdistettua RNA:ta ja DNA:ta tarvitaan lukuisiin erilaisiin testaustarkoituksiin.
Nukleiinihappojen uuttamisen sovelluksia terveydenhuollossa ovat:
- Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS)
- Amplifikaatioon perustuva SNP-genotyypitys
- Array-pohjainen genotyypitys
- Restriktioentsyymien pilkkominen
- Analyysit modifioivien entsyymien avulla (esim. ligaatio ja kloonaus)
Terveydenhuollon lisäksi on myös muita aloja, joilla nukleiinihappojen uuttamista käytetään, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, isyystestaus, rikostekninen tutkimus ja genomiikka.
Lyhyt historia nukleiinihappojen uuttamisesta
DNA:n eristäminenjuontaa juurensa kauas menneisyyteen, ja ensimmäisen tunnetun eristämisen suoritti sveitsiläinen lääkäri nimeltä Friedrich Miescher vuonna 1869. Miescher toivoi ratkaisevansa elämän perusperiaatteet määrittämällä solujen kemiallisen koostumuksen. Epäonnistuttuaan lymfosyyttien kanssa hän onnistui saamaan raakaa DNA-saostumaa poisheitettyjen siteiden mädästä löytyneistä leukosyyteistä. Hän teki tämän lisäämällä soluun happoa ja sitten emästä, jotta se poistuu solun sytoplasmasta, ja kehitti sitten protokollan DNA:n erottamiseksi muista proteiineista.
Miescherin uraauurtavan tutkimuksen jälkeen monet muut tiedemiehet ovat kehittäneet tekniikoita DNA:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Proteiinitutkija Edwin Joseph Cohn kehitti monia tekniikoita proteiinien puhdistamiseksi toisen maailmansodan aikana. Hän vastasi veriplasman seerumin albumiinifraktion eristämisestä, mikä on tärkeää verisuonten osmoottisen paineen ylläpitämiseksi. Tämä oli ratkaisevan tärkeää sotilaiden hengissä pitämiseksi.
Vuonna 1953 Francis Crick määritti yhdessä Rosalind Franklinin ja James Watsonin kanssa DNA:n rakenteen ja osoitti, että se koostui kahdesta pitkästä nukleiinihapponukleotidiketjusta. Tämä läpimurtoinen löytö tasoitti tietä Meselsonille ja Stahlille, jotka pystyivät kehittämään tiheysgradienttisentrifugointiprotokollan DNA:n eristämiseksi E. coli -bakteereista osoittaen DNA:n puolikonservatiivisen replikaation vuoden 1958 kokeessaan.
Nukleiinihappojen uuttotekniikat
Mitkä ovat DNA:n eristyksen neljä vaihetta?
Kaikki uuttomenetelmät tiivistyvät samoihin perusvaiheisiin.
Solujen häiriötTämä vaihe, joka tunnetaan myös solulyysinä, sisältää soluseinän ja/tai solukalvon hajoamisen, jotta vapautuu solunsisäisiä nesteitä, jotka sisältävät kiinnostuksen kohteena olevia nukleiinihappoja.
Ei-toivottujen roskien poisto. Tähän sisältyvät kalvolipidit, proteiinit ja muut ei-toivotut nukleiinihapot, jotka voivat häiritä jatkosovelluksia.
Eristäminen. Kiinnostuksen kohteena olevien nukleiinihappojen eristämiseen luomastasi kirkastetusta lysaatista on useita eri tapoja, jotka voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: liuospohjaiseen tai kiinteän olomuodon eristämiseen (katso seuraava osio).
Konsentrointi. Kun nukleiinihapot on eristetty kaikista muista kontaminanteista ja laimennusaineista, ne esitetään erittäin konsentroidussa eluaatissa.
Kaksi uuttamistyyppiä
Nukleiinihappojen uuttamista on kahdenlaisia: liuospohjaisia menetelmiä ja kiinteän olomuodon menetelmiä. Liuospohjaista menetelmää kutsutaan myös kemialliseksi uuttomenetelmäksi, koska siinä käytetään kemikaaleja solun hajottamiseen ja nukleiinimateriaalin käyttämiseen. Tässä voidaan käyttää joko orgaanisia yhdisteitä, kuten fenolia ja kloroformia, tai vähemmän haitallisia ja siksi suositeltavampia epäorgaanisia yhdisteitä, kuten proteinaasi K:ta tai silikageeliä.
Esimerkkejä erilaisista kemiallisista uuttomenetelmistä solun hajottamiseksi ovat:
- Kalvon osmoottinen repeäminen
- Soluseinän entsymaattinen pilkkominen
- Kalvon liukeneminen
- Pesuaineiden kanssa
- Alkalikäsittelyllä
Kiinteän olomuodon tekniikat, jotka tunnetaan myös mekaanisina menetelminä, hyödyntävät DNA:n ja kiinteän substraatin vuorovaikutusta. Valitsemalla helmen tai molekyylin, johon DNA sitoutuu, mutta analyytti ei, on mahdollista erottaa nämä kaksi. Esimerkkejä kiinteän faasin uuttotekniikoista ovat piidioksidin ja magneettisten helmien käyttö.
Magneettisten helmien poisto selitettynä
Magneettisen helmen uuttomenetelmä
Magneettisten helmien avulla tehtävän uuttamisen mahdollisuudet tunnistettiin ensimmäisen kerran Trevor Hawkinsin Whitehead-instituutin tutkimuslaitokselle jättämässä yhdysvaltalaisessa patentissa. Patentissa tunnustettiin, että geneettistä materiaalia oli mahdollista uuttaa sitomalla se kiinteään alustaan, joka voisi olla magneettinen helmi. Periaatteena on, että käytetään erittäin funktionalisoitua magneettista helmeä, johon geneettinen materiaali kiinnittyy, ja joka voidaan sitten erottaa supernatantista kohdistamalla magneettinen voima näytettä sisältävän astian ulkopuolelle.
Miksi käyttää magneettista helmien poistoa?
Magneettihelmien uuttotekniikka on yleistymässä, koska se tarjoaa mahdollisuuden nopeisiin ja tehokkaisiin uuttomenetelmiin. Viime aikoina on kehitetty erittäin toiminnallisia magneettihelmiä, joissa on sopivat puskurijärjestelmät. Nämä menetelmät ovat mahdollistaneet nukleiinihappojen uuton automatisoinnin ja erittäin resurssitehokkaan ja kustannustehokkaan työnkulun. Magneettihelmien uuttomenetelmissä ei myöskään käytetä sentrifugointivaiheita, jotka voivat aiheuttaa leikkausvoimia, jotka rikkovat pidempiä DNA-paloja. Tämä tarkoittaa, että pidemmät DNA-säikeet pysyvät ehjinä, mikä on tärkeää genomitutkimuksessa.
Julkaisun aika: 25.11.2022