Zavedení
Co je extrakce nukleových kyselin?
Nejjednodušeji řečeno, extrakce nukleových kyselin je odstranění RNA a/nebo DNA ze vzorku a veškerého nepotřebného přebytečného materiálu. Proces extrakce izoluje nukleové kyseliny ze vzorku a poskytuje je ve formě koncentrovaného eluátu, bez ředidel a kontaminantů, které by mohly ovlivnit jakékoli následné aplikace.
Aplikace extrakce nukleových kyselin
Purifikované nukleové kyseliny se používají v celé řadě různých aplikací v různých odvětvích. Zdravotnictví je pravděpodobně oblastí, kde se používají nejvíce, kde je purifikovaná RNA a DNA potřebná pro řadu různých testovacích účelů.
Mezi aplikace extrakce nukleových kyselin ve zdravotnictví patří:
- Sekvenování nové generace (NGS)
- Genotypizace SNP založená na amplifikaci
- Genotypizace založená na maticích
- Trávení restrikčními enzymy
- Analýzy s využitím modifikujících enzymů (např. ligace a klonování)
Existují i další oblasti kromě zdravotnictví, kde se extrakce nukleových kyselin používá, včetně, ale nikoli výhradně, testování otcovství, forenzní vědy a genomiky.
Stručná historie extrakce nukleových kyselin
Extrakce DNAsahá daleko do minulosti, přičemž první známou izolaci provedl švýcarský lékař Friedrich Miescher v roce 1869. Miescher doufal, že vyřeší základní principy života určením chemického složení buněk. Poté, co se mu nepodařilo získat lymfocyty, se mu podařilo získat surovou sraženinu DNA z leukocytů nalezených v hnisu na odhozených obvazech. Udělal to tak, že do buňky přidal kyselinu a poté zásadu, aby opustil buněčnou cytoplazmu, a poté vyvinul protokol pro oddělení DNA od ostatních proteinů.
V návaznosti na Miescherův průlomový výzkum mnoho dalších vědců pokračovalo v rozvíjení technik izolace a čištění DNA. Edwin Joseph Cohn, vědec zabývající se proteiny, vyvinul během druhé světové války mnoho technik pro purifikaci proteinů. Byl zodpovědný za izolaci frakce sérového albuminu z krevní plazmy, která je důležitá pro udržení osmotického tlaku v cévách. To bylo klíčové pro udržení vojáků naživu.
V roce 1953 Francis Crick spolu s Rosalind Franklinovou a Jamesem Watsonem určili strukturu DNA a ukázali, že se skládá ze dvou řetězců dlouhých řetězců nukleových kyselin a nukleotidů. Tento průlomový objev vydláždil cestu Meselsonovi a Stahlovi, kteří byli schopni vyvinout protokol centrifugace v gradientu hustoty k izolaci DNA z bakterie E. coli, když během svého experimentu v roce 1958 demonstrovali semikonzervativní replikaci DNA.
Techniky extrakce nukleových kyselin
Jaké jsou 4 fáze extrakce DNA?
Všechny metody extrakce se scvrkávají na stejné základní kroky.
Narušení buněkTato fáze, známá také jako buněčná lýza, zahrnuje rozpad buněčné stěny a/nebo buněčné membrány za účelem uvolnění intracelulární tekutiny obsahující sledované nukleové kyseliny.
Odstranění nežádoucích nečistot. Patří sem membránové lipidy, proteiny a další nežádoucí nukleové kyseliny, které mohou narušovat následné aplikace.
Izolace. Existuje řada různých způsobů, jak izolovat sledované nukleové kyseliny z vyčištěného lyzátu, které jste vytvořili, a které spadají do dvou hlavních kategorií: v roztoku nebo v pevném stavu (viz další část).
Koncentrace. Po izolaci nukleových kyselin od všech ostatních kontaminantů a ředidel jsou tyto prezentovány ve vysoce koncentrovaném eluátu.
Dva typy extrakce
Existují dva typy extrakce nukleových kyselin – metody založené na roztoku a metody v pevné fázi. Metoda založená na roztoku je také známá jako metoda chemické extrakce, protože zahrnuje použití chemikálií k rozkladu buňky a přístupu k nukleovému materiálu. Může se použít buď organické sloučeniny, jako je fenol a chloroform, nebo méně škodlivé a proto doporučovanější anorganické sloučeniny, jako je proteináza K nebo silikagel.
Mezi příklady různých metod chemické extrakce pro rozklad buňky patří:
- Osmotické protržení membrány
- Enzymatické štěpení buněčné stěny
- Solubilizace membrány
- S čisticími prostředky
- S alkalickou úpravou
Techniky extrakce v pevné fázi, známé také jako mechanické metody, zahrnují využití interakce DNA s pevným substrátem. Výběrem kuličky nebo molekuly, na kterou se DNA naváže, ale analyt nikoli, je možné tyto dvě látky oddělit. Mezi příklady technik extrakce v pevné fázi patří použití oxidu křemičitého a magnetických kuliček.
Vysvětlení extrakce magnetických kuliček
Metoda extrakce magnetických kuliček
Potenciál extrakce pomocí magnetických kuliček byl poprvé rozpoznán v americkém patentu, který podal Trevor Hawkins pro výzkumnou instituci Whitehead Institute. Tento patent uznal, že je možné extrahovat genetický materiál jeho navázáním na pevný nosič, kterým může být magnetická kulička. Princip spočívá v použití vysoce funkcionalizované magnetické kuličky, na kterou se genetický materiál naváže, a kterou lze poté oddělit od supernatantu působením magnetické síly na vnější stranu nádoby se vzorkem.
Proč používat magnetickou extrakci kuliček?
Technologie extrakce magnetickými kuličkami se stává stále rozšířenější díky potenciálu, který nabízí pro rychlé a efektivní extrakční postupy. V poslední době došlo k vývoji vysoce funkcionalizovaných magnetických kuliček s vhodnými pufrovacími systémy, které umožnily automatizaci extrakce nukleových kyselin a pracovní postup, který je velmi nenáročný na zdroje a nákladově efektivní. Metody extrakce magnetickými kuličkami také nezahrnují kroky centrifugace, které mohou způsobovat smykové síly, jež rozrušují delší části DNA. To znamená, že delší řetězce DNA zůstávají neporušené, což je důležité při genomickém testování.
Čas zveřejnění: 25. listopadu 2022