Въведение
Какво е екстракция на нуклеинови киселини?
Най-просто казано, екстракцията на нуклеинови киселини е отстраняване на РНК и/или ДНК от проба и целия излишък, който не е необходим. Процесът на екстракция изолира нуклеиновите киселини от пробата и ги дава под формата на концентриран елуат, без разредители и замърсители, които биха могли да повлияят на последващите приложения.
Приложения на екстракцията на нуклеинови киселини
Пречистените нуклеинови киселини се използват в множество различни приложения, обхващащи множество различни индустрии. Здравеопазването е може би областта, в която се използват най-много, като пречистена РНК и ДНК са необходими за множество различни тестови цели.
Приложенията на екстракцията на нуклеинови киселини в здравеопазването включват:
- Секвениране от следващо поколение (NGS)
- SNP генотипизиране, базирано на амплификация
- Генотипизиране на базата на масиви
- Разграждане с рестрикционни ензими
- Анализи с помощта на модифициращи ензими (напр. лигиране и клониране)
Съществуват и други области извън здравеопазването, където се използва екстракция на нуклеинови киселини, включително, но не само, тестове за бащинство, криминалистика и геномика.
Кратка история на екстракцията на нуклеинови киселини
Екстракция на ДНКдатира отдавна, като първото известно изолиране е извършено от швейцарски лекар на име Фридрих Мишер през 1869 г. Мишер се надявал да разреши фундаменталните принципи на живота, като определи химичния състав на клетките. След неуспех с лимфоцитите, той успял да получи сурова утайка от ДНК от левкоцити, открити в гной върху изхвърлени превръзки. Той направил това, като добавил киселина, а след това и алкали към клетката, за да напусне цитоплазмата на клетката, и след това разработил протокол за отделяне на ДНК от другите протеини.
Следвайки новаторските изследвания на Мишер, много други учени са развили техники за изолиране и пречистване на ДНК. Едуин Джоузеф Кон, учен, специализиран в протеините, е разработил много техники за пречистване на протеини по време на Втората световна война. Той е отговорен за изолирането на серумната албуминова фракция от кръвната плазма, която е важна за поддържане на осмотичното налягане в кръвоносните съдове. Това е било от решаващо значение за запазването на живота на войниците.
През 1953 г. Франсис Крик, заедно с Розалинд Франклин и Джеймс Уотсън, определят структурата на ДНК, показвайки, че тя е съставена от две нишки дълги вериги от нуклеинови киселини и нуклеотиди. Това революционно откритие проправя пътя за Мезелсън и Щал, които успяват да разработят протокол за центрофугиране с градиент на плътност, за да изолират ДНК от бактерии E. coli, демонстрирайки полуконсервативната репликация на ДНК по време на експеримента си от 1958 г.
Техники за екстракция на нуклеинови киселини
Кои са 4-те етапа на екстракция на ДНК?
Всички методи за екстракция се свеждат до едни и същи основни стъпки.
Разрушаване на клеткитеТози етап, известен още като клетъчен лизис, включва разрушаване на клетъчната стена и/или клетъчната мембрана, за да се освободят вътреклетъчните течности, съдържащи интересуващите ни нуклеинови киселини.
Премахване на нежелани отломки. Това включва мембранни липиди, протеини и други нежелани нуклеинови киселини, които могат да повлияят на последващите приложения.
Изолиране. Съществуват редица различни начини за изолиране на интересуващите ни нуклеинови киселини от създадения от вас пречистен лизат, които попадат в две основни категории: на базата на разтвор или в твърдо състояние (вижте следващия раздел).
Концентриране. След като нуклеиновите киселини са изолирани от всички други замърсители и разредители, те се представят във високо концентриран елуат.
Двата вида екстракция
Съществуват два вида екстракция на нуклеинови киселини – методи, базирани на разтвор, и методи в твърдо състояние. Методът, базиран на разтвор, е известен още като метод на химическа екстракция, тъй като включва използването на химикали за разграждане на клетката и достъп до нуклеиновия материал. Това може да се осъществи чрез използване на органични съединения като фенол и хлороформ или по-малко вредни и следователно по-препоръчителни неорганични съединения като протеиназа К или силикагел.
Примери за различни методи за химическа екстракция за разграждане на клетка включват:
- Осмотично разкъсване на мембраната
- Ензимно разграждане на клетъчната стена
- Разтваряне на мембраната
- С детергенти
- С алкална обработка
Твърдофазните техники, известни още като механични методи, включват използване на начина, по който ДНК взаимодейства с твърд субстрат. Чрез избиране на перла или молекула, към която ДНК ще се свърже, но аналитът не, е възможно двете да се разделят. Примери за техники за твърдофазна екстракция включват използване на силициев диоксид и магнитни перли.
Обяснение на екстракцията с магнитни перли
Методът за екстракция с магнитни перли
Потенциалът за екстракция с помощта на магнитни перли е признат за първи път в американски патент, подаден от Тревър Хокинс за изследователската институция Whitehead Institute. Този патент признава, че е възможно да се екстрахира генетичен материал чрез свързването му с твърд носител, който може да бъде магнитна перла. Принципът е, че се използва високо функционализирана магнитна перла, върху която ще се свърже генетичният материал, който след това може да бъде отделен от супернатантата чрез прилагане на магнитна сила към външната страна на съда, съдържащ пробата.
Защо да използваме магнитна екстракция с мъниста?
Технологията за екстракция с магнитни перли става все по-разпространена, поради потенциала, който тя притежава за бързи и ефикасни процедури за екстракция. Напоследък се наблюдават разработки на високо функционализирани магнитни перли с подходящи буферни системи, които направиха възможна автоматизацията на екстракцията на нуклеинови киселини и работен процес, който е много ресурсоемък и рентабилен. Също така, методите за екстракция с магнитни перли не включват стъпките на центрофугиране, които могат да причинят сили на срязване, които разкъсват по-дългите парчета ДНК. Това означава, че по-дългите вериги ДНК остават непокътнати, което е важно при геномното тестване.
Време на публикуване: 25 ноември 2022 г.