Уводзіны
Што такое экстракцыя нуклеінавых кіслот?
Найпрасцей кажучы, экстракцыя нуклеінавых кіслот — гэта выдаленне РНК і/або ДНК з узору і ўсяго непатрэбнага лішку. Працэс экстракцыі вылучае нуклеінавыя кіслоты з узору і дае іх у выглядзе канцэнтраванага элюата, без разбаўляльнікаў і забруджванняў, якія могуць паўплываць на любыя наступныя прымяненні.
Прымяненне экстракцыі нуклеінавых кіслот
Ачышчаныя нуклеінавыя кіслоты выкарыстоўваюцца ў мностве розных ужыванняў у розных галінах прамысловасці. Ахова здароўя, мабыць, з'яўляецца сферай, дзе яны выкарыстоўваюцца найбольш часта, дзе ачышчаная РНК і ДНК патрабуюцца для мноства розных мэтаў тэставання.
Прымяненне экстракцыі нуклеінавых кіслот у ахове здароўя ўключае:
- Секвенаванне наступнага пакалення (NGS)
- Генатыпаванне SNP на аснове ампліфікацыі
- Генатыпаванне на аснове масіваў
- Рэстрыкцыйнае ферментнае пераварванне
- Аналізы з выкарыстаннем мадыфікуючых ферментаў (напрыклад, лігаванне і кланаванне)
Акрамя аховы здароўя, існуюць і іншыя галіны, дзе выкарыстоўваецца экстракцыя нуклеінавых кіслот, у тым ліку, але не абмяжоўваючыся імі, тэставанне бацькоўства, крыміналістыка і геноміка.
Кароткая гісторыя экстракцыі нуклеінавых кіслот
Экстракцыя ДНКІснаванне ДНК мае даўнюю гісторыю, бо першае вядомае вылучэнне ДНК было зроблена швейцарскім лекарам па імені Фрыдрых Мішэр у 1869 годзе. Мішэр спадзяваўся разгадаць фундаментальныя прынцыпы жыцця, вызначыўшы хімічны склад клетак. Пасля няўдачы з лімфацытамі ён здолеў атрымаць неапрацаваны асадак ДНК з лейкацытаў, знойдзеных у гноі на выкінутых бінтах. Ён зрабіў гэта, дадаўшы ў клетку кіслату, а затым шчолач, каб пакінуць цытаплазму клеткі, а затым распрацаваў пратакол для аддзялення ДНК ад іншых бялкоў.
Пасля рэвалюцыйных даследаванняў Мішэра многія іншыя навукоўцы працягвалі развіваць і ўдасканальваць метады вылучэння і ачысткі ДНК. Эдвін Джозэф Кон, спецыяліст па бялках, распрацаваў шмат метадаў ачысткі бялкоў падчас Другой сусветнай вайны. Ён адказваў за вылучэнне фракцыі сыроватачнага альбуміна плазмы крыві, якая важная для падтрымання асматычнага ціску ў крывяносных сасудах. Гэта мела вырашальнае значэнне для захавання жыцця салдат.
У 1953 годзе Фрэнсіс Крык разам з Разалінд Франклін і Джэймсам Уотсанам вызначылі структуру ДНК, паказаўшы, што яна складаецца з двух нітак доўгіх ланцугоў нуклеатыдаў нуклеінавых кіслот. Гэтае прарыўное адкрыццё праклала шлях для Мезельсана і Шталя, якія змаглі распрацаваць пратакол цэнтрыфугавання ў градыенце шчыльнасці для вылучэння ДНК з бактэрый E. coli, прадэманстраваўшы паўкансерватыўную рэплікацыю ДНК падчас свайго эксперыменту 1958 года.
Метады экстракцыі нуклеінавых кіслот
Якія 4 этапы экстракцыі ДНК?
Усе метады здабычы зводзяцца да адных і тых жа асноўных этапаў.
Парушэнне працы клетакГэты этап, таксама вядомы як лізіс клетак, уключае разбурэнне клеткавай сценкі і/або клеткавай мембраны, каб вызваліць унутрыклеткавыя вадкасці, якія змяшчаюць цікавыя нуклеінавыя кіслоты.
Выдаленне непажаданых адходаў. Сюды ўваходзяць мембранныя ліпіды, бялкі і іншыя непажаданыя нуклеінавыя кіслоты, якія могуць перашкаджаць далейшым працэсам.
Вылучэнне. Існуе шэраг розных спосабаў вылучэння цікавых нуклеінавых кіслот з атрыманага вамі ачышчанага лізату, якія падпадаюць пад дзве асноўныя катэгорыі: у растворы або ў цвёрдым стане (гл. наступны раздзел).
Канцэнтрацыя. Пасля таго, як нуклеінавыя кіслоты былі вылучаны ад усіх іншых забруджвальнікаў і разбаўляльнікаў, яны прадстаўлены ў выглядзе высокаканцэнтраванага элюата.
Два тыпы здабычы
Існуе два тыпы экстракцыі нуклеінавых кіслот: метады на аснове раствора і метады ў цвёрдым стане. Метад на аснове раствора таксама вядомы як метад хімічнай экстракцыі, бо ён прадугледжвае выкарыстанне хімічных рэчываў для расшчаплення клеткі і доступу да нуклеінавага матэрыялу. Гэта можа быць зроблена з выкарыстаннем арганічных злучэнняў, такіх як фенол і хлараформ, або менш шкодных і таму больш рэкамендаваных неарганічных злучэнняў, такіх як пратэіназа К або сілікагель.
Прыкладамі розных метадаў хімічнай экстракцыі для разбурэння клеткі з'яўляюцца:
- Асматычны разрыў мембраны
- Ферментатыўнае пераварванне клеткавай сценкі
- Растварэнне мембраны
- З мыйнымі сродкамі
- З шчолачнай апрацоўкай
Цвёрдафазныя метады, таксама вядомыя як механічныя метады, прадугледжваюць выкарыстанне таго, як ДНК узаемадзейнічае з цвёрдым субстратам. Выбіраючы шарык або малекулу, з якой будзе звязвацца ДНК, а аналіт не, можна падзяліць іх. Прыкладамі метадаў цвёрдафазнай экстракцыі з'яўляюцца выкарыстанне дыяксіду крэмнію і магнітных шарыкаў.
Тлумачэнне здабывання магнітных шарыкаў
Метад экстракцыі магнітных шарыкаў
Патэнцыял экстракцыі з выкарыстаннем магнітных шарыкаў быў упершыню прызнаны ў патэнце ЗША, пададзеным Трэварам Хокінсам для даследчай установы Інстытута Уайтхеда. У гэтым патэнце прызнавалася магчымасць экстракцыі генетычнага матэрыялу шляхам яго звязвання з цвёрдым носьбітам, якім можа быць магнітная шарыка. Прынцып заключаецца ў тым, што выкарыстоўваецца высокафункцыяналізаваная магнітная шарыка, на якую звязваецца генетычны матэрыял, які затым можна аддзяліць ад супернатанту, прыклаўшы магнітную сілу да вонкавага боку пасудзіны, якая змяшчае ўзор.
Чаму варта выкарыстоўваць магнітную экстракцыю шарыкаў?
Тэхналогія экстракцыі магнітнымі шарыкамі становіцца ўсё больш распаўсюджанай дзякуючы патэнцыялу, які яна мае для хуткіх і эфектыўных працэдур экстракцыі. У апошні час былі распрацаваны высокафункцыяналізаваныя магнітныя шарыкі з адпаведнымі буфернымі сістэмамі, якія дазволілі аўтаматызаваць экстракцыю нуклеінавых кіслот і стварыць працоўны працэс, які вельмі рэсурсаёмісты і эканамічна эфектыўны. Акрамя таго, метады экстракцыі магнітнымі шарыкамі не ўключаюць этапы цэнтрыфугавання, якія могуць выклікаць сілы зруху, што разбураюць больш доўгія кавалкі ДНК. Гэта азначае, што больш доўгія ніткі ДНК застаюцца цэлымі, што важна пры геномным тэсціраванні.
Час публікацыі: 25 лістапада 2022 г.