Inleiding
Wat is nukleïensuur-ekstraksie?
In die heel eenvoudigste terme is nukleïensuur-ekstraksie die verwydering van die RNS en/of DNS uit 'n monster en al die oortollige wat nie nodig is nie. Die proses van ekstraksie isoleer die nukleïensure uit 'n monster en lewer hulle in die vorm van 'n gekonsentreerde eluaat, vry van verdunningsmiddels en kontaminante wat enige stroomaf toepassings kan beïnvloed.
Toepassings van nukleïensuur-ekstraksie
Gesuiwerde nukleïensure word in 'n oorvloed verskillende toepassings gebruik, wat oor verskeie verskillende industrieë strek. Gesondheidsorg is miskien die gebied waar dit die meeste gebruik word, met gesuiwerde RNA en DNA wat vir 'n menigte verskillende toetsdoeleindes benodig word.
Toepassings van nukleïensuur-ekstraksie in gesondheidsorg sluit in:
- Volgende Generasie Volgordebepaling (NGS)
- Amplifikasie-gebaseerde SNP-genotipering
- Skikking-gebaseerde genotipering
- Restriksie-ensiemvertering
- Analises met behulp van Modifiserende Ensieme (bv. Ligasie en Kloning)
Daar is ook ander velde buite gesondheidsorg waar nukleïensuurekstraksie gebruik word, insluitend maar nie beperk tot vaderskapstoetsing, forensiese ondersoeke en genomika.
'n Kort Geskiedenis van Nukleïensuur-ekstraksie
DNS-ekstraksiedateer 'n lang tyd terug, met die eerste bekende isolasie wat in 1869 deur 'n Switserse geneesheer genaamd Friedrich Miescher uitgevoer is. Miescher het gehoop om die fundamentele beginsels van lewe op te los deur die chemiese samestelling van selle te bepaal. Nadat hy met limfosiete misluk het, kon hy 'n ru-presipitaat van DNS verkry uit leukosiete wat in etter op weggegooide verbande gevind is. Hy het dit gedoen deur suur en dan alkali by die sel te voeg om die sel se sitoplasma te verlaat, en het toe 'n protokol ontwikkel om die DNS van die ander proteïene te skei.
Na aanleiding van Miescher se baanbrekersnavorsing het baie ander wetenskaplikes voortgegaan om tegnieke te ontwikkel om DNS te isoleer en te suiwer. Edwin Joseph Cohn, 'n proteïenwetenskaplike, het baie tegnieke vir proteïensuiwering tydens die Tweede Wêreldoorlog ontwikkel. Hy was verantwoordelik vir die isolering van die serumalbumienfraksie van bloedplasma, wat belangrik is om die osmotiese druk in die bloedvate te handhaaf. Dit was van kardinale belang om soldate aan die lewe te hou.
In 1953 het Francis Crick, saam met Rosalind Franklin en James Watson, die struktuur van DNS bepaal en getoon dat dit uit twee stringe lang kettings van nukleïensuurnukleotiede bestaan. Hierdie deurbraak-ontdekking het die weg gebaan vir Meselson en Stahl, wat 'n digtheidsgradiënt-sentrifugasieprotokol kon ontwikkel om DNS van E. coli-bakterieë te isoleer, aangesien hulle die semi-konserwatiewe replikasie van DNS tydens hul 1958-eksperiment gedemonstreer het.
Tegnieke van Nukleïensuur-ekstraksie
Wat is die 4 stadiums van DNA-ekstraksie?
Alle ekstraksiemetodes kom neer op dieselfde fundamentele stappe.
SelontwrigtingHierdie stadium, ook bekend as sellise, behels die afbreek van die selwand en/of die selmembraan, om die intrasellulêre vloeistowwe wat die nukleïensure van belang bevat, vry te stel.
Verwydering van ongewenste puin. Dit sluit membraanlipiede, proteïene en ander ongewenste nukleïensure in wat met stroomaftoepassings kan inmeng.
Isolasie. Daar is 'n aantal verskillende maniere om die nukleïensure van belang te isoleer van die skoongemaakte lisaat wat jy geskep het, wat tussen twee hoofkategorieë val: oplossinggebaseerd of vastetoestand (sien volgende afdeling).
Konsentrasie. Nadat die nukleïensure van alle ander kontaminante en verdunningsmiddels geïsoleer is, word hulle in 'n hoogs gekonsentreerde eluaat aangebied.
Die twee tipes ekstraksie
Daar is twee tipes nukleïensuur-ekstraksie – oplossingsgebaseerde metodes en vastetoestandmetodes. Die oplossingsgebaseerde metode staan ook bekend as die chemiese ekstraksiemetode, aangesien dit die gebruik van chemikalieë behels om die sel af te breek en toegang tot die nukleïensmateriaal te verkry. Dit kan óf organiese verbindings soos fenol en chloroform, óf die minder skadelike en dus meer aanbevole anorganiese verbindings soos Proteinase K of silikagel, gebruik.
Voorbeelde van verskillende chemiese ekstraksiemetodes om 'n sel af te breek, sluit in:
- Osmotiese breuk van die membraan
- Ensiematiese vertering van selwand
- Oplosbaarheid van membraan
- Met skoonmaakmiddels
- Met alkaliese behandeling
Vastetoestandtegnieke, ook bekend as meganiese metodes, behels die benutting van hoe DNS met 'n vaste substraat in wisselwerking tree. Deur 'n kraal of molekule te kies waaraan die DNS sal bind, maar die analiet nie, is dit moontlik om die twee te skei. Voorbeelde van vastefase-ekstraksietegnieke sluit in die gebruik van silika en magnetiese krale.
Magnetiese Krale-ekstraksie verduidelik
Die Magnetiese Kraal Ekstraksie Metode
Die potensiaal vir ekstraksie met behulp van magnetiese krale is die eerste keer erken in 'n Amerikaanse patent wat deur Trevor Hawkins vir die Whitehead Instituut-navorsingsinstituut ingedien is. Hierdie patent het erken dat dit moontlik is om genetiese materiaal te ekstraheer deur dit aan 'n soliede draer te bind, wat 'n magnetiese kraal kan wees. Die beginsel is dat jy 'n hoogs gefunksionaliseerde magnetiese kraal gebruik waaraan die genetiese materiaal sal bind, wat dan van die supernatant geskei kan word deur 'n magnetiese krag op die buitekant van die houer wat die monster bevat, toe te pas.
Waarom magnetiese kraal-ekstraksie gebruik?
Magnetiese kraal-ekstraksietegnologie word toenemend algemeen as gevolg van die potensiaal wat dit inhou vir vinnige en doeltreffende ekstraksieprosedures. In onlangse tye was daar ontwikkelings van hoogs gefunksionaliseerde magnetiese krale met geskikte bufferstelsels, wat die outomatisering van nukleïensuur-ekstraksie en 'n werkvloei moontlik gemaak het wat baie hulpbron-lig en koste-effektief is. Boonop behels magnetiese kraal-ekstraksiemetodes nie die sentrifugeringstappies wat skuifkragte kan veroorsaak wat langer stukke DNS opbreek nie. Dit beteken dat langer stringe DNS ongeskonde bly, wat belangrik is in genomika-toetsing.
Plasingstyd: 25 Nov 2022