Вступ
Що таке екстракція нуклеїнових кислот?
Найпростіше кажучи, екстракція нуклеїнових кислот – це видалення РНК та/або ДНК зі зразка та всього зайвого. Процес екстракції ізолює нуклеїнові кислоти зі зразка та дає їх у вигляді концентрованого елюату, вільного від розріджувачів та забруднень, які можуть вплинути на будь-які подальші застосування.
Застосування екстракції нуклеїнових кислот
Очищені нуклеїнові кислоти використовуються в безлічі різних застосувань у різних галузях промисловості. Охорона здоров'я, мабуть, є сферою, де вони використовуються найбільше, де очищена РНК і ДНК потрібні для низки різних цілей тестування.
Застосування екстракції нуклеїнових кислот у охороні здоров'я включає:
- Секвенування наступного покоління (NGS)
- Генотипування SNP на основі ампліфікації
- Генотипування на основі масивів
- Травлення рестрикційними ферментами
- Аналізи з використанням модифікуючих ферментів (наприклад, лігування та клонування)
Існують також інші галузі, окрім охорони здоров'я, де використовується екстракція нуклеїнових кислот, включаючи, але не обмежуючись, тестування на батьківство, криміналістику та геноміку.
Коротка історія екстракції нуклеїнових кислот
Екстракція ДНКсягає давньої історії, адже перше відоме виділення було здійснено швейцарським лікарем Фрідріхом Мішером у 1869 році. Мішер сподівався розгадати фундаментальні принципи життя, визначивши хімічний склад клітин. Після невдачі з лімфоцитами він зміг отримати неочищений осад ДНК з лейкоцитів, знайдених у гної на викинутих бинтах. Він зробив це, додавши кислоту, а потім луг до клітини, щоб вийти з цитоплазми клітини, а потім розробив протокол для відділення ДНК від інших білків.
Після новаторських досліджень Мішера багато інших вчених продовжили розробку методів виділення та очищення ДНК. Едвін Джозеф Кон, вчений-білок, розробив багато методів очищення білків під час Другої світової війни. Він відповідав за виділення фракції сироваткового альбуміну плазми крові, яка важлива для підтримки осмотичного тиску в кровоносних судинах. Це було вирішальним фактором для збереження життя солдатів.
У 1953 році Френсіс Крік разом із Розалінд Франклін та Джеймсом Вотсоном визначили структуру ДНК, показавши, що вона складається з двох ланцюгів довгих ланцюгів нуклеїнових кислот-нуклеотидів. Це революційне відкриття проклало шлях для Мезельсона та Шталя, які змогли розробити протокол центрифугування в градієнті щільності для виділення ДНК з бактерій E. coli, продемонструвавши напівконсервативну реплікацію ДНК під час свого експерименту 1958 року.
Методи екстракції нуклеїнових кислот
Які 4 етапи екстракції ДНК?
Усі методи екстракції зводяться до одних і тих самих фундаментальних кроків.
Порушення роботи клітинЦя стадія, також відома як лізис клітин, включає руйнування клітинної стінки та/або клітинної мембрани з метою вивільнення внутрішньоклітинних рідин, що містять нуклеїнові кислоти, що цікавлять.
Видалення небажаних залишків. Це включає мембранні ліпіди, білки та інші небажані нуклеїнові кислоти, які можуть перешкоджати подальшим застосуванням.
Виділення. Існує кілька різних способів виділення нуклеїнових кислот, що цікавлять, з очищеного лізату, який ви створили, які поділяються на дві основні категорії: у розчині або у твердому стані (див. наступний розділ).
Концентрування. Після того, як нуклеїнові кислоти були виділені від усіх інших забруднювачів та розріджувачів, їх подають у висококонцентрованому елюаті.
Два типи видобутку
Існує два типи екстракції нуклеїнових кислот – методи на основі розчину та твердофазні методи. Метод на основі розчину також відомий як метод хімічної екстракції, оскільки він передбачає використання хімічних речовин для розщеплення клітини та доступу до нуклеїнового матеріалу. Це може бути використання як органічних сполук, таких як фенол і хлороформ, так і менш шкідливих і тому більш рекомендованих неорганічних сполук, таких як протеїназа К або силікагель.
Приклади різних методів хімічної екстракції для руйнування клітини включають:
- Осмотичний розрив мембрани
- Ферментативне розщеплення клітинної стінки
- Солюбілізація мембрани
- З мийними засобами
- З лужною обробкою
Твердофазні методи, також відомі як механічні методи, передбачають використання того, як ДНК взаємодіє з твердим субстратом. Вибравши кульку або молекулу, з якою зв'язуватиметься ДНК, а аналіт ні, можна розділити їх. Прикладами методів твердофазної екстракції є використання діоксиду кремнію та магнітних кульок.
Пояснення екстракції магнітних кульок
Метод екстракції магнітними кульками
Потенціал екстракції за допомогою магнітних кульок був вперше визнаний у патенті США, поданому Тревором Хокінсом для дослідницької установи Інституту Вайтхеда. У цьому патенті визнавалася можливість екстракції генетичного матеріалу шляхом його зв'язування з твердим носієм, яким може бути магнітна кулька. Принцип полягає у використанні високофункціональної магнітної кульки, з якою зв'язується генетичний матеріал, який потім можна відокремити від супернатанту, приклавши магнітну силу до зовнішньої сторони посудини, що містить зразок.
Чому варто використовувати магнітну екстракцію кульок?
Технологія екстракції магнітними кульками стає все більш поширеною завдяки потенціалу, який вона має для швидких та ефективних процедур екстракції. Останнім часом були розроблені високофункціоналізовані магнітні кульки з відповідними буферними системами, що дозволило автоматизувати екстракцію нуклеїнових кислот та створити робочий процес, який є дуже ресурсомістким та економічно ефективним. Крім того, методи екстракції магнітними кульками не передбачають етапів центрифугування, які можуть викликати сили зсуву, що розривають довші фрагменти ДНК. Це означає, що довші ланцюги ДНК залишаються неушкодженими, що важливо для геномного тестування.
Час публікації: 25 листопада 2022 р.