giriiş
Nükleik Asit Ekstraksiyonu Nedir?
En basit ifadeyle, nükleik asit ekstraksiyonu, bir numuneden RNA ve/veya DNA'nın ve gerekli olmayan tüm fazlalıkların çıkarılmasıdır. Ekstraksiyon süreci, nükleik asitleri bir numuneden izole eder ve bunları, herhangi bir alt akış uygulamasını etkileyebilecek seyrelticilerden ve kirleticilerden arındırılmış, konsantre bir eluat formunda verir.
Nükleik Asit Ekstraksiyonunun Uygulamaları
Saflaştırılmış nükleik asitler, birçok farklı endüstride çeşitli farklı uygulamalarda kullanılır. Sağlık, muhtemelen en çok kullanıldığı alandır ve saflaştırılmış RNA ve DNA, çok sayıda farklı test amacı için gereklidir.
Nükleik asit ekstraksiyonunun sağlık alanındaki uygulamaları şunlardır:
- Yeni Nesil Dizileme (NGS)
- Amplifikasyona Dayalı SNP Genotipleme
- Dizi Tabanlı Genotipleme
- Restriksiyon Enzim Sindirimi
- Değiştirici Enzimler Kullanılarak Yapılan Analizler (Örneğin Ligasyon ve Klonlama)
Nükleik asit ekstraksiyonunun kullanıldığı sağlık sektörünün ötesinde, babalık testi, adli tıp ve genomik gibi başka alanlar da bulunmaktadır.
Nükleik Asit Ekstraksiyonunun Kısa Tarihi
DNA çıkarımıuzun bir geçmişe dayanır ve bilinen ilk izolasyon 1869'da Friedrich Miescher adlı bir İsviçreli doktor tarafından gerçekleştirilmiştir. Miescher, hücrelerin kimyasal bileşimini belirleyerek yaşamın temel prensiplerini çözmeyi umuyordu. Lenfositlerde başarısız olduktan sonra, atılan bandajlardaki irin içinde bulunan lökositlerden kaba bir DNA çökeltisi elde etmeyi başardı. Bunu, hücrenin sitoplazmasını terk etmek için hücreye asit ve ardından alkali ekleyerek yaptı ve ardından DNA'yı diğer proteinlerden ayırmak için bir protokol geliştirdi.
Miescher'in çığır açan araştırmasının ardından, birçok başka bilim insanı DNA'yı izole etmek ve saflaştırmak için teknikler geliştirmeye ve ilerletmeye devam etti. Protein bilimcisi Edwin Joseph Cohn, 2. Dünya Savaşı sırasında protein saflaştırma için birçok teknik geliştirdi. Kan damarlarındaki ozmotik basıncı korumada önemli olan kan plazmasının serum albümin fraksiyonunu izole etmekten sorumluydu. Bu, askerleri hayatta tutmak için çok önemliydi.
1953'te Francis Crick, Rosalind Franklin ve James Watson ile birlikte DNA'nın yapısını belirleyerek, uzun nükleik asit nükleotid zincirlerinden oluşan iki iplikten oluştuğunu gösterdi. Bu çığır açan keşif, 1958 deneyleri sırasında DNA'nın yarı-muhafazakar replikasyonunu gösterdikleri sırada E. Coli bakterilerinden DNA izole etmek için bir yoğunluk gradyan santrifüjleme protokolü geliştirebilen Meselson ve Stahl için yolu açtı.
Nükleik Asit Çıkarma Teknikleri
DNA çıkarma işleminin 4 aşaması nelerdir?
Tüm ekstraksiyon yöntemleri aynı temel adımlara dayanır.
Hücre BozulmasıHücre lizizi olarak da bilinen bu aşama, hücre duvarının ve/veya hücre zarının parçalanarak, ilgili nükleik asitleri içeren hücre içi sıvıların serbest bırakılmasını içerir.
İstenmeyen Enkazların Giderilmesi. Buna, aşağı akış uygulamalarına müdahale edebilen membran lipidleri, proteinler ve diğer istenmeyen nükleik asitler dahildir.
İzolasyon. Oluşturduğunuz temizlenmiş lizattan ilgi çekici nükleik asitleri izole etmenin birkaç farklı yolu vardır ve bunlar iki ana kategoriye ayrılır: çözelti bazlı veya katı hal (bir sonraki bölüme bakın).
Konsantrasyon. Nükleik asitler diğer tüm kontaminantlardan ve seyrelticilerden izole edildikten sonra, yüksek konsantrasyonlu bir eluatta sunulurlar.
İki Tür Çıkarım
İki tür nükleik asit çıkarma vardır: çözelti tabanlı yöntemler ve katı hal yöntemleri. Çözelti tabanlı yöntem, hücreyi parçalamak ve nükleik materyale erişmek için kimyasallar kullanmayı içerdiğinden kimyasal çıkarma yöntemi olarak da bilinir. Bu, fenol ve kloroform gibi organik bileşikler veya Proteinase K veya silika jel gibi daha az zararlı ve bu nedenle daha çok önerilen inorganik bileşikler kullanılarak yapılabilir.
Bir hücreyi parçalamak için kullanılan farklı kimyasal çıkarma yöntemlerine örnekler şunlardır:
- Membranın ozmotik yırtılması
- Hücre duvarının enzimatik sindirimi
- Membranın çözündürülmesi
- Deterjanlarla
- Alkali işlemle
Katı hal teknikleri, mekanik yöntemler olarak da bilinir, DNA'nın katı bir substratla nasıl etkileşime girdiğini kullanmayı içerir. DNA'nın bağlanacağı ancak analitin bağlanmayacağı bir boncuk veya molekül seçerek ikisini ayırmak mümkündür. Silika ve manyetik boncukların kullanımı da dahil olmak üzere katı faz çıkarma tekniklerine örnekler.
Manyetik Boncuk Çıkarımının Açıklaması
Manyetik Boncuk Çıkarma Yöntemi
Manyetik boncuklar kullanılarak çıkarma potansiyeli ilk olarak Trevor Hawkins tarafından Whitehead Enstitüsü araştırma kurumu için sunulan bir ABD patentinde tanındı. Bu patent, genetik materyali manyetik boncuk olabilecek katı bir destek taşıyıcıya bağlayarak çıkarmanın mümkün olduğunu kabul etti. Prensip, genetik materyalin bağlanacağı son derece işlevselleştirilmiş bir manyetik boncuk kullanmanız ve ardından numuneyi tutan kabın dışına manyetik bir kuvvet uygulayarak süpernatanttan ayrılmasıdır.
Manyetik Boncuk Çıkarımı Neden Kullanılır?
Manyetik boncuk çıkarma teknolojisi, hızlı ve etkili çıkarma prosedürleri için sahip olduğu potansiyel nedeniyle giderek daha yaygın hale geliyor. Son zamanlarda, nükleik asit çıkarma otomasyonunu ve çok kaynak tasarrufu sağlayan ve maliyet açısından verimli bir iş akışını mümkün kılan uygun tampon sistemlerine sahip oldukça işlevselleştirilmiş manyetik boncuklar geliştirildi. Ayrıca, manyetik boncuk çıkarma yöntemleri, daha uzun DNA parçalarını parçalayan kesme kuvvetlerine neden olabilen santrifüjleme adımlarını içermez. Bu, daha uzun DNA dizilerinin sağlam kaldığı anlamına gelir ve bu da genomik testlerde önemlidir.
Yayınlanma zamanı: 25-Kas-2022