การสกัดกรดนิวคลีอิกและวิธีลูกปัดแม่เหล็ก

การแนะนำ

การสกัดกรดนิวคลีอิกคืออะไร?

การสกัดกรดนิวคลีอิกแบบง่ายที่สุดก็คือการกำจัด RNA และ/หรือ DNA ออกจากตัวอย่างและส่วนเกินทั้งหมดที่ไม่จำเป็น กระบวนการสกัดจะแยกกรดนิวคลีอิกออกจากตัวอย่างและผลิตกรดนิวคลีอิกออกมาในรูปของสารละลายเข้มข้นที่ปราศจากสารเจือจางและสารปนเปื้อนที่อาจส่งผลต่อการใช้งานในขั้นตอนต่อไป

การประยุกต์ใช้การสกัดกรดนิวคลีอิก

กรดนิวคลีอิกที่บริสุทธิ์นั้นใช้ในแอปพลิเคชันต่างๆ มากมาย ซึ่งครอบคลุมอุตสาหกรรมต่างๆ มากมาย ในด้านการดูแลสุขภาพอาจเป็นด้านที่มีการใช้กรดนิวคลีอิกมากที่สุด โดยจำเป็นต้องใช้ RNA และ DNA ที่บริสุทธิ์เพื่อจุดประสงค์การทดสอบที่แตกต่างกันมากมาย

การประยุกต์ใช้การสกัดกรดนิวคลีอิกในการดูแลสุขภาพ ได้แก่ :

- การขยาย PCR และ qPCR

- การจัดลำดับแบบเจเนอเรชั่นถัดไป (NGS)

- การสร้างจีโนไทป์ SNP ตามการขยายพันธุ์

- การสร้างจีโนไทป์โดยใช้พื้นฐานอาร์เรย์

- การย่อยด้วยเอนไซม์จำกัด

- การวิเคราะห์โดยใช้เอนไซม์ดัดแปลง (เช่น การเชื่อมโยงและการโคลน)

นอกจากนี้ยังมีสาขาอื่นๆ นอกเหนือจากการดูแลสุขภาพที่ใช้วิธีสกัดกรดนิวคลีอิก เช่น การทดสอบความเป็นพ่อ นิติเวชศาสตร์ และจีโนมิกส์ เป็นต้น

ประวัติโดยย่อของการสกัดกรดนิวคลีอิก

การสกัดดีเอ็นเอการแยกเซลล์ครั้งแรกที่ทราบกันนั้นทำโดยแพทย์ชาวสวิสชื่อฟรีดริช มีเชอร์ในปี 1869 มีเชอร์หวังว่าจะไขหลักพื้นฐานของชีวิตได้โดยการกำหนดองค์ประกอบทางเคมีของเซลล์ หลังจากล้มเหลวกับเซลล์ลิมโฟไซต์ เขาก็สามารถสกัดดีเอ็นเอที่ตกตะกอนหยาบจากเม็ดเลือดขาวที่พบในหนองบนผ้าพันแผลที่ทิ้งแล้วได้ เขาทำได้โดยเติมกรดและด่างลงในเซลล์เพื่อออกจากไซโทพลาซึมของเซลล์ จากนั้นจึงพัฒนาโปรโตคอลเพื่อแยกดีเอ็นเอออกจากโปรตีนอื่นๆ

หลังจากการวิจัยอันล้ำสมัยของ Miescher นักวิทยาศาสตร์คนอื่นๆ จำนวนมากได้ก้าวหน้าและพัฒนาวิธีการในการแยกและแยก DNA ออกจากกัน Edwin Joseph Cohn นักวิทยาศาสตร์ด้านโปรตีนได้พัฒนาวิธีการต่างๆ มากมายสำหรับการแยกโปรตีนออกจากกันในช่วงสงครามโลกครั้งที่ 2 เขาเป็นผู้รับผิดชอบในการแยกเศษส่วนอัลบูมินในซีรั่มของพลาสมาเลือด ซึ่งมีความสำคัญในการรักษาความดันออสโมซิสในหลอดเลือด ซึ่งถือเป็นสิ่งสำคัญในการทำให้ทหารมีชีวิตอยู่ได้

ในปี 1953 ฟรานซิส คริก ร่วมกับโรซาลินด์ แฟรงคลิน และเจมส์ วัตสัน ได้กำหนดโครงสร้างของดีเอ็นเอ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าดีเอ็นเอประกอบด้วยสายยาวสองสายของนิวคลีโอไทด์กรดนิวคลีอิก การค้นพบครั้งสำคัญนี้ปูทางให้กับเมเซลสันและสตาห์ล ซึ่งสามารถพัฒนาโปรโตคอลการปั่นเหวี่ยงแบบไล่ระดับความหนาแน่นเพื่อแยกดีเอ็นเอจากแบคทีเรียอีโคไลได้ โดยพวกเขาสาธิตการจำลองดีเอ็นเอแบบกึ่งอนุรักษ์นิยมในระหว่างการทดลองในปี 1958

เทคนิคการสกัดกรดนิวคลีอิก

ขั้นตอนการสกัด DNA มีทั้งหมด 4 ขั้นตอน มีอะไรบ้าง?
วิธีการสกัดทั้งหมดสรุปลงเป็นขั้นตอนพื้นฐานเดียวกัน

การหยุดชะงักของเซลล์ระยะนี้เรียกอีกอย่างว่า ระยะไลซิสของเซลล์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการทำลายผนังเซลล์และ/หรือเยื่อหุ้มเซลล์ เพื่อปลดปล่อยของเหลวภายในเซลล์ที่มีกรดนิวคลีอิกที่สนใจ

การกำจัดเศษวัสดุที่ไม่ต้องการ ซึ่งรวมถึงลิพิดเมมเบรน โปรตีน และกรดนิวคลีอิกที่ไม่ต้องการอื่นๆ ซึ่งอาจรบกวนการใช้งานในภายหลัง

การแยก มีวิธีต่างๆ มากมายในการแยกกรดนิวคลีอิกที่ต้องการจากไลเสทที่ใสซึ่งคุณสร้างขึ้น โดยจะแบ่งออกเป็นสองประเภทหลัก ได้แก่ การแยกตามสารละลายหรือการแยกตามสถานะของแข็ง (ดูหัวข้อถัดไป)

การทำให้เข้มข้น หลังจากแยกกรดนิวคลีอิกออกจากสารปนเปื้อนและสารเจือจางอื่นๆ ทั้งหมดแล้ว กรดนิวคลีอิกจะถูกนำเสนอในสารละลายที่มีความเข้มข้นสูง

การสกัดมี 2 ประเภท
การสกัดกรดนิวคลีอิกมี 2 ประเภท ได้แก่ วิธีที่ใช้สารละลายและวิธีของแข็ง วิธีที่ใช้สารละลายเรียกอีกอย่างหนึ่งว่าวิธีการสกัดทางเคมี เนื่องจากเกี่ยวข้องกับการใช้สารเคมีเพื่อสลายเซลล์และเข้าถึงสารนิวคลีอิก ซึ่งอาจใช้สารประกอบอินทรีย์ เช่น ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม หรือสารประกอบอนินทรีย์ที่เป็นอันตรายน้อยกว่าและแนะนำมากกว่า เช่น โปรตีเนสเค หรือซิลิกาเจล

ตัวอย่างของวิธีการสกัดทางเคมีที่แตกต่างกันเพื่อทำลายเซลล์ ได้แก่:

- การแตกของเยื่อหุ้มเนื่องจากออสโมซิส

- การย่อยผนังเซลล์ด้วยเอนไซม์

- การทำให้เมมเบรนละลายได้

- พร้อมผงซักฟอก

- ด้วยการบำบัดด้วยด่าง

เทคนิคโซลิดสเตต หรือที่เรียกอีกอย่างว่าวิธีเชิงกล เกี่ยวข้องกับการใช้ประโยชน์จากวิธีที่ DNA โต้ตอบกับสารตั้งต้นที่เป็นของแข็ง โดยการเลือกลูกปัดหรือโมเลกุลที่ DNA จะจับกับแต่สารวิเคราะห์จะไม่จับ ทำให้สามารถแยกทั้งสองออกจากกันได้ ตัวอย่างของเทคนิคการสกัดเฟสของแข็ง เช่น การใช้ซิลิกาและลูกปัดแม่เหล็ก

คำอธิบายการสกัดด้วยลูกปัดแม่เหล็ก

วิธีการสกัดด้วยลูกปัดแม่เหล็ก
ศักยภาพในการสกัดโดยใช้ลูกปัดแม่เหล็กได้รับการยอมรับเป็นครั้งแรกในสิทธิบัตรของสหรัฐอเมริกาที่ยื่นโดย Trevor Hawkins สำหรับสถาบันวิจัย Whitehead Institute สิทธิบัตรนี้ยอมรับว่าสามารถสกัดสารพันธุกรรมได้โดยการจับกับวัสดุรองรับที่เป็นของแข็ง ซึ่งอาจเป็นลูกปัดแม่เหล็ก หลักการคือใช้ลูกปัดแม่เหล็กที่มีฟังก์ชันสูงซึ่งวัสดุพันธุกรรมจะจับกับลูกปัดแม่เหล็ก ซึ่งสามารถแยกออกจากของเหลวที่อยู่เหนือตะกอนได้โดยการใช้แรงแม่เหล็กกับด้านนอกของภาชนะที่บรรจุตัวอย่าง

เหตุใดจึงต้องใช้การสกัดลูกปัดแม่เหล็ก?
เทคโนโลยีการสกัดด้วยลูกปัดแม่เหล็กกำลังได้รับความนิยมเพิ่มมากขึ้น เนื่องมาจากมีศักยภาพในการสกัดอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการพัฒนาลูกปัดแม่เหล็กที่มีฟังก์ชันการทำงานสูงพร้อมระบบบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ซึ่งทำให้การสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นไปได้โดยอัตโนมัติ และเวิร์กโฟลว์ยังใช้ทรัพยากรน้อยและคุ้มทุนอีกด้วย นอกจากนี้ วิธีการสกัดด้วยลูกปัดแม่เหล็กยังไม่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนการปั่นเหวี่ยงซึ่งอาจทำให้เกิดแรงเฉือนที่ทำให้ชิ้นส่วนของ DNA ที่ยาวขึ้นแตกออก ซึ่งหมายความว่าสายของ DNA ที่ยาวขึ้นจะยังคงอยู่เหมือนเดิม ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญในการทดสอบจีโนมิกส์