Extracția acidului nucleic și metoda cu perle magnetice

Introducere

Ce este extracția acidului nucleic?

În termeni simpli, extracția acidului nucleic este îndepărtarea ARN-ului și/sau ADN-ului dintr-o probă și a excesului care nu este necesar. Procesul de extracție izolează acizii nucleici dintr-o probă și îi produce sub forma unui eluat concentrat, fără diluanți și contaminanți care ar putea afecta orice aplicații ulterioare.

Aplicații ale extracției acidului nucleic

Acizii nucleici purificați sunt utilizați într-o multitudine de aplicații diferite, variind în mai multe industrii diferite. Domeniul medical este probabil domeniul în care sunt utilizați cel mai mult, ARN-ul și ADN-ul purificat fiind necesari pentru o multitudine de scopuri de testare diferite.

Aplicațiile extracției de acid nucleic în domeniul sănătății includ:

- Amplificare PCR și qPCR

- Secvențiere de generație următoare (NGS)

- Genotiparea SNP bazată pe amplificare

- Genotipare bazată pe array-uri

- Digestia cu enzime de restricție

- Analize folosind enzime modificatoare (de exemplu, ligatură și clonare)

Există și alte domenii dincolo de asistența medicală în care se utilizează extracția acidului nucleic, inclusiv, dar fără a se limita la, testarea paternității, criminalistica și genomica.

O scurtă istorie a extracției acidului nucleic

Extracția ADN-uluidatează de mult timp, prima izolare cunoscută fiind efectuată de un medic elvețian pe nume Friedrich Miescher în 1869. Miescher spera să rezolve principiile fundamentale ale vieții prin determinarea compoziției chimice a celulelor. După ce nu a reușit cu limfocitele, a reușit să obțină un precipitat brut de ADN din leucocitele găsite în puroiul de pe bandaje aruncate. A făcut acest lucru adăugând acid și apoi alcali în celulă pentru a părăsi citoplasma celulei și apoi a dezvoltat un protocol pentru a separa ADN-ul de celelalte proteine.

În urma cercetărilor inovatoare ale lui Miescher, mulți alți oameni de știință au continuat să dezvolte tehnici de izolare și purificare a ADN-ului. Edwin Joseph Cohn, un specialist în proteine, a dezvoltat numeroase tehnici pentru purificarea proteinelor în timpul celui de-al Doilea Război Mondial. El a fost responsabil pentru izolarea fracției de albumină serică din plasma sanguină, care este importantă în menținerea presiunii osmotice în vasele de sânge. Acest lucru a fost crucial pentru menținerea în viață a soldaților.

În 1953, Francis Crick, împreună cu Rosalind Franklin și James Watson, au determinat structura ADN-ului, arătând că acesta era alcătuit din două catene lungi de nucleotide de acid nucleic. Această descoperire revoluționară a deschis calea pentru Meselson și Stahl, care au reușit să dezvolte un protocol de centrifugare cu gradient de densitate pentru a izola ADN-ul din bacteria E. coli, demonstrând replicarea semiconservativă a ADN-ului în timpul experimentului lor din 1958.

Tehnici de extracție a acidului nucleic

Care sunt cele 4 etape ale extracției ADN-ului?
Toate metodele de extracție se reduc la aceiași pași fundamentali.

Întreruperea celulelorAceastă etapă, cunoscută și sub denumirea de liză celulară, implică descompunerea peretelui celular și/sau a membranei celulare, pentru a elibera fluidele intracelulare care conțin acizii nucleici de interes.

Îndepărtarea resturilor nedorite. Acestea includ lipidele membranare, proteinele și alți acizi nucleici nedoriți care pot interfera cu aplicațiile din aval.

Izolare. Există o serie de modalități diferite de a izola acizii nucleici de interes din lizatul purificat creat, care se încadrează în două categorii principale: în soluție sau în stare solidă (vezi secțiunea următoare).

Concentrație. După ce acizii nucleici au fost izolați de toți ceilalți contaminanți și diluanți, aceștia sunt prezentați într-un eluat foarte concentrat.

Cele două tipuri de extracție
Există două tipuri de extracție a acidului nucleic – metode bazate pe soluție și metode în stare solidă. Metoda bazată pe soluție este cunoscută și sub denumirea de metodă de extracție chimică, deoarece implică utilizarea substanțelor chimice pentru a descompune celula și a accesa materialul nucleic. Aceasta poate fi realizată fie cu compuși organici, cum ar fi fenolul și cloroformul, fie cu compuși anorganici mai puțin nocivi și, prin urmare, mai recomandați, cum ar fi proteinaza K sau silicagelul.

Exemple de diferite metode de extracție chimică pentru descompunerea unei celule includ:

- Ruptura osmotică a membranei

- Digestia enzimatică a peretelui celular

- Solubilizarea membranei

- Cu detergenți

- Cu tratament alcalin

Tehnicile în stare solidă, cunoscute și sub denumirea de metode mecanice, implică exploatarea modului în care ADN-ul interacționează cu un substrat solid. Prin selectarea unei sfere sau molecule de care ADN-ul se va lega, dar analitul nu, este posibilă separarea celor două. Exemple de tehnici de extracție în fază solidă includ utilizarea silicei și a sferelor magnetice.

Extracția cu perle magnetice explicată

Metoda de extracție a bilelor magnetice
Potențialul extracției folosind sfere magnetice a fost recunoscut pentru prima dată într-un brevet american depus de Trevor Hawkins pentru institutul de cercetare Whitehead Institute. Acest brevet recunoștea că era posibilă extragerea materialului genetic prin legarea acestuia la un suport solid, care ar putea fi o sferă magnetică. Principiul este că se utilizează o sferă magnetică înalt funcționalizată de care se va lega materialul genetic, care poate fi apoi separată de supernatant prin aplicarea unei forțe magnetice pe exteriorul vasului care conține proba.

De ce să se utilizeze extracția cu perle magnetice?
Tehnologia de extracție cu sfere magnetice devine din ce în ce mai răspândită, datorită potențialului pe care îl are pentru proceduri de extracție rapide și eficiente. În ultima vreme, au existat dezvoltări de sfere magnetice înalt funcționalizate, cu sisteme tampon adecvate, care au făcut posibilă automatizarea extracției acidului nucleic și un flux de lucru foarte puțin utilizat din punct de vedere al resurselor și eficient din punct de vedere al costurilor. De asemenea, metodele de extracție cu sfere magnetice nu implică etapele de centrifugare care pot provoca forțe de forfecare ce descompun fragmente mai lungi de ADN. Aceasta înseamnă că segmentele mai lungi de ADN rămân intacte, ceea ce este important în testarea genomică.