Introduzione
Che cosa è l'estrazione degli acidi nucleici?
In termini molto semplici, l'estrazione degli acidi nucleici consiste nella rimozione dell'RNA e/o del DNA da un campione e di tutto l'eccesso non necessario. Il processo di estrazione isola gli acidi nucleici da un campione e li restituisce sotto forma di un eluato concentrato, privo di diluenti e contaminanti che potrebbero influenzare le applicazioni successive.
Applicazioni dell'estrazione degli acidi nucleici
Gli acidi nucleici purificati vengono utilizzati in una miriade di applicazioni diverse, che spaziano in molteplici settori. Il settore sanitario è forse quello in cui vengono maggiormente utilizzati, con RNA e DNA purificati necessari per una miriade di scopi di analisi diversi.
Le applicazioni dell'estrazione di acidi nucleici in ambito sanitario includono:
- Sequenziamento di nuova generazione (NGS)
- Genotipizzazione SNP basata sull'amplificazione
- Genotipizzazione basata su array
- Digestione con enzimi di restrizione
- Analisi mediante enzimi modificatori (ad esempio legatura e clonazione)
Esistono anche altri campi oltre all'assistenza sanitaria in cui viene utilizzata l'estrazione di acidi nucleici, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, i test di paternità, la medicina legale e la genomica.
Una breve storia dell'estrazione degli acidi nucleici
Estrazione del DNArisale a molto tempo fa, con il primo isolamento noto effettuato da un medico svizzero di nome Friedrich Miescher nel 1869. Miescher sperava di risolvere i principi fondamentali della vita determinando la composizione chimica delle cellule. Dopo aver fallito con i linfociti, riuscì a ottenere un precipitato grezzo di DNA dai leucociti trovati nel pus su bende di scarto. Ci riuscì aggiungendo acido e poi alcali alla cellula per estrarne il citoplasma, e sviluppò quindi un protocollo per separare il DNA dalle altre proteine.
Dopo la ricerca rivoluzionaria di Miescher, molti altri scienziati hanno continuato a sviluppare e perfezionare tecniche per isolare e purificare il DNA. Edwin Joseph Cohn, uno scienziato specializzato in proteine, sviluppò numerose tecniche per la purificazione delle proteine durante la Seconda Guerra Mondiale. Fu responsabile dell'isolamento della frazione di albumina sierica del plasma sanguigno, importante per il mantenimento della pressione osmotica nei vasi sanguigni. Questo era fondamentale per la sopravvivenza dei soldati.
Nel 1953 Francis Crick, insieme a Rosalind Franklin e James Watson, determinò la struttura del DNA, dimostrando che era composto da due filamenti di lunghe catene di nucleotidi di acidi nucleici. Questa scoperta rivoluzionaria aprì la strada a Meselson e Stahl, che furono in grado di sviluppare un protocollo di centrifugazione in gradiente di densità per isolare il DNA dai batteri E. coli, dimostrando la replicazione semi-conservativa del DNA durante il loro esperimento del 1958.
Tecniche di estrazione degli acidi nucleici
Quali sono le 4 fasi dell'estrazione del DNA?
Tutti i metodi di estrazione si riducono agli stessi passaggi fondamentali.
Disgregazione cellulareQuesta fase, nota anche come lisi cellulare, comporta la rottura della parete cellulare e/o della membrana cellulare, al fine di liberare i fluidi intracellulari contenenti gli acidi nucleici di interesse.
Rimozione di detriti indesiderati. Tra questi, lipidi di membrana, proteine e altri acidi nucleici indesiderati che possono interferire con le applicazioni successive.
Isolamento. Esistono diversi metodi per isolare gli acidi nucleici di interesse dal lisato purificato creato, che rientrano in due categorie principali: in soluzione o allo stato solido (vedi sezione successiva).
Concentrazione. Dopo essere stati isolati da tutti gli altri contaminanti e diluenti, gli acidi nucleici vengono presentati in un eluato altamente concentrato.
I due tipi di estrazione
Esistono due tipi di estrazione degli acidi nucleici: metodi in soluzione e metodi allo stato solido. Il metodo in soluzione è anche noto come metodo di estrazione chimica, poiché prevede l'utilizzo di sostanze chimiche per scomporre la cellula e accedere al materiale nucleico. Possono essere utilizzati composti organici come fenolo e cloroformio, oppure composti inorganici meno dannosi e quindi più raccomandati come la proteinasi K o il gel di silice.
Esempi di diversi metodi di estrazione chimica per scomporre una cellula includono:
- Rottura osmotica della membrana
- Digestione enzimatica della parete cellulare
- Solubilizzazione della membrana
- Con detersivi
- Con trattamento alcalino
Le tecniche allo stato solido, note anche come metodi meccanici, sfruttano il modo in cui il DNA interagisce con un substrato solido. Selezionando una biglia o una molecola a cui il DNA si legherà ma l'analita no, è possibile separare i due. Esempi di tecniche di estrazione in fase solida includono l'utilizzo di silice e biglie magnetiche.
Estrazione di microsfere magnetiche spiegata
Il metodo di estrazione delle perle magnetiche
Il potenziale dell'estrazione mediante biglie magnetiche è stato riconosciuto per la prima volta in un brevetto statunitense depositato da Trevor Hawkins per l'istituto di ricerca Whitehead Institute. Questo brevetto riconosceva la possibilità di estrarre materiale genetico legandolo a un supporto solido, che potrebbe essere una biglia magnetica. Il principio consiste nell'utilizzare una biglia magnetica altamente funzionalizzata a cui si lega il materiale genetico, che può poi essere separato dal surnatante applicando una forza magnetica all'esterno del contenitore contenente il campione.
Perché utilizzare l'estrazione con sfere magnetiche?
La tecnologia di estrazione con biglie magnetiche sta diventando sempre più diffusa, grazie al potenziale che offre per procedure di estrazione rapide ed efficienti. Recentemente, sono state sviluppate biglie magnetiche altamente funzionalizzate con sistemi tampone adeguati, che hanno reso possibile l'automazione dell'estrazione degli acidi nucleici e un flusso di lavoro estremamente leggero ed economico. Inoltre, i metodi di estrazione con biglie magnetiche non prevedono le fasi di centrifugazione, che possono causare forze di taglio che frantumano i frammenti di DNA più lunghi. Ciò significa che i filamenti di DNA più lunghi rimangono intatti, un aspetto importante nei test genomici.
Data di pubblicazione: 25-11-2022