Útdráttur kjarnsýru og segulperluaðferðin

Inngangur

Hvað er kjarnsýruútdráttur?

Einfaldast sagt er kjarnsýruútdráttur að fjarlægja RNA og/eða DNA úr sýni og allt umframmagn sem er óþarfi. Útdráttarferlið einangrar kjarnsýrurnar úr sýninu og gefur þær í formi þétts skolvökva, lausan við þynningarefni og mengunarefni sem gætu haft áhrif á notkun síðar.

Notkun kjarnsýruútdráttar

Hreinsaðar kjarnsýrur eru notaðar í fjölmörgum mismunandi tilgangi, í mörgum atvinnugreinum. Heilbrigðisþjónustan er líklega það svið þar sem þær eru mest notaðar, þar sem hreinsað RNA og DNA er nauðsynlegt fyrir fjölbreytt prófunartilgangi.

Notkun kjarnsýruútdráttar í heilbrigðisþjónustu eru meðal annars:

- PCR og qPCR mögnun

- Næstu kynslóðar raðgreining (NGS)

- SNP erfðagreining byggð á mögnun

- Fylkisbundin erfðagreining

- Melting með takmörkunarensímum

- Greiningar með því að nota breytandi ensím (t.d. límingu og klónun)

Það eru einnig önnur svið umfram heilbrigðisþjónustu þar sem kjarnsýruútdráttur er notaður, þar á meðal en ekki takmarkað við faðernispróf, réttarlæknisfræði og erfðafræði.

Stutt saga um kjarnsýruútdrátt

DNA-útdrátturá rætur sínar að rekja til langrar sögu, þar sem fyrsta þekkta einangrunin var framkvæmd af svissneskum lækni að nafni Friedrich Miescher árið 1869. Miescher vonaðist til að leysa grundvallarreglur lífsins með því að ákvarða efnasamsetningu frumna. Eftir að hafa mistekist með eitilfrumum tókst honum að fá gróft botnfall af DNA úr hvítfrumum sem fundust í gröft á umbúðum sem höfðu verið fjarlægðar. Hann gerði þetta með því að bæta sýru og síðan basa við frumuna til að skilja eftir umfrymi hennar og þróaði síðan aðferð til að aðskilja DNA-ið frá öðrum próteinum.

Í kjölfar byltingarkenndra rannsókna Mieschers hafa margir aðrir vísindamenn haldið áfram að þróa aðferðir til að einangra og hreinsa DNA. Edwin Joseph Cohn, próteinfræðingur, þróaði margar aðferðir til próteinhreinsunar í seinni heimsstyrjöldinni. Hann var ábyrgur fyrir því að einangra sermisalbúmínhlutfall blóðvökva, sem er mikilvægt til að viðhalda osmósuþrýstingi í æðum. Þetta var lykilatriði til að halda hermönnum á lífi.

Árið 1953 ákvarðaði Francis Crick, ásamt Rosalind Franklin og James Watson, uppbyggingu DNA og sýndi fram á að það var gert úr tveimur þráðum af löngum keðjum af kjarnsýrunúkleótíðum. Þessi byltingarkennda uppgötvun ruddi brautina fyrir Meselson og Stahl, sem gátu þróað þéttleikahalla skilvinduaðferð til að einangra DNA úr E. coli bakteríum og sýndu fram á hálf-varðveitta afritun DNA í tilraun sinni árið 1958.

Aðferðir við útdrátt kjarnsýru

Hver eru 4 stig DNA-útdráttar?
Allar útdráttaraðferðir snúast um sömu grundvallarskrefin.

FrumuröskunÞetta stig, einnig þekkt sem frumulýsa, felur í sér að brjóta niður frumuvegginn og/eða frumuhimnuna til að losa innanfrumuvökva sem innihalda kjarnsýrurnar sem um ræðir.

Fjarlæging óæskilegra úrgangs. Þetta felur í sér himnulípíð, prótein og aðrar óæskilegar kjarnsýrur sem geta truflað notkun eftir á.

Einangrun. Það eru nokkrar mismunandi leiðir til að einangra kjarnsýrurnar sem um ræðir úr hreinsuðu lýsatinu sem þú bjóst til, sem falla í tvo meginflokka: lausnarbundnar eða fastar leiðir (sjá næsta kafla).

Þétting. Eftir að kjarnsýrurnar hafa verið einangraðar frá öllum öðrum mengunarefnum og þynningarefnum eru þær kynntar í mjög þéttri elúeringu.

Tvær gerðir útdráttar
Það eru tvær gerðir af kjarnsýruútdráttaraðferðum - lausnaraðferðir og fastfasaaðferðir. Lausnaraðferðin er einnig þekkt sem efnaútdráttaraðferð, þar sem hún felur í sér að nota efni til að brjóta niður frumuna og komast að kjarnefninu. Þetta getur verið annað hvort með því að nota lífræn efnasambönd eins og fenól og klóróform, eða minna skaðleg og því ráðlögð ólífræn efnasambönd eins og próteinasa K eða kísilgel.

Dæmi um mismunandi efnafræðilegar útdráttaraðferðir til að brjóta niður frumur eru:

- Osmótísk sprunga í himnu

- Ensímmelting frumuveggja

- Leysni himnunnar

- Með þvottaefnum

- Með basískri meðferð

Fastfasa aðferðir, einnig þekktar sem vélrænar aðferðir, fela í sér að nýta hvernig DNA hefur samskipti við fast undirlag. Með því að velja perlu eða sameind sem DNA-ið binst við en greiniefnið ekki, er hægt að aðgreina þær tvær. Dæmi um fastfasa útdráttaraðferðir eru meðal annars notkun kísil og segulperla.

Útskýring á segulperlum

Aðferðin við segulperluútdrátt
Möguleikinn á útdrátt með segulperlum var fyrst viðurkenndur í bandarísku einkaleyfi sem Trevor Hawkins sótti um fyrir rannsóknarstofnunina Whitehead Institute. Þetta einkaleyfi viðurkenndi að það væri mögulegt að vinna erfðaefni út með því að binda það við fastan burðarefni, sem gæti verið segulperla. Meginreglan er sú að notaðar eru mjög virkjaðar segulperlur sem erfðaefnið binst við, sem síðan er hægt að aðskilja frá yfirborðsvökvanum með því að beita segulkrafti á ytra byrði ílátsins sem geymir sýnið.

Af hverju að nota segulperluútdrátt?
Tækni til að útdráttar segulperla er að verða sífellt algengari vegna möguleika sem hún hefur í för með sér fyrir hraðari og skilvirkari útdráttaraðferðir. Á undanförnum árum hefur verið þróað mjög virknisérhæfð segulperla með viðeigandi stuðpúðakerfum, sem hafa gert kleift að sjálfvirknivæða útdrátt kjarnsýru og vinna verkflæði sem er mjög auðlindalítið og hagkvæmt. Einnig fela útdráttaraðferðir með segulperlum ekki í sér skilvinduskref sem geta valdið klippikrafti sem brjóta upp lengri DNA-hluta. Þetta þýðir að lengri DNA-þræðir haldast óskemmdir, sem er mikilvægt í erfðafræðilegum prófunum.