Introdución
Que é a extracción de ácidos nucleicos?
En termos máis sinxelos, a extracción de ácidos nucleicos é a eliminación do ARN e/ou ADN dunha mostra e de todo o exceso que non sexa necesario. O proceso de extracción illa os ácidos nucleicos dunha mostra e prodúceos en forma dun eluato concentrado, libre de diluíntes e contaminantes que poderían afectar calquera aplicación posterior.
Aplicacións da extracción de ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos purificados utilízanse nunha gran cantidade de aplicacións diferentes, que abarcan múltiples industrias diferentes. A saúde é quizais o ámbito onde máis se emprega, xa que se require ARN e ADN purificados para unha serie de diferentes fins de análise.
As aplicacións da extracción de ácidos nucleicos na atención sanitaria inclúen:
- Amplificación por PCR e qPCR
- Secuenciación de Nova Xeración (NGS)
- Xenotipificación de SNP baseada na amplificación
- Xenotipificación baseada en matrices
- Dixestión con encimas de restrición
- Análises mediante encimas modificadores (por exemplo, ligación e clonación)
Tamén hai outros campos ademais da atención sanitaria onde se emprega a extracción de ácidos nucleicos, incluíndo, entre outros, as probas de paternidade, a ciencia forense e a xenómica.
Unha breve historia da extracción de ácidos nucleicos
Extracción de ADNremóntase a moitísimo tempo, sendo o primeiro illamento coñecido o realizado por un médico suízo chamado Friedrich Miescher en 1869. Miescher esperaba resolver os principios fundamentais da vida determinando a composición química das células. Tras fallar cos linfocitos, conseguiu obter un precipitado bruto de ADN a partir de leucocitos atopados no pus de vendaxes descartadas. Fíxoo engadindo ácido e despois álcali á célula para que abandonase o citoplasma da célula, e despois desenvolveu un protocolo para separar o ADN das outras proteínas.
Tras a innovadora investigación de Miescher, moitos outros científicos avanzaron e desenvolveron técnicas para illar e purificar o ADN. Edwin Joseph Cohn, un científico de proteínas, desenvolveu moitas técnicas para a purificación de proteínas durante a Segunda Guerra Mundial. Foi o responsable de illar a fracción de albumina sérica do plasma sanguíneo, que é importante para manter a presión osmótica nos vasos sanguíneos. Isto foi crucial para manter con vida os soldados.
En 1953, Francis Crick, xunto con Rosalind Franklin e James Watson, determinou a estrutura do ADN, mostrando que estaba composto por dúas febras de longas cadeas de nucleótidos de ácidos nucleicos. Este descubrimento innovador abriu o camiño para Meselson e Stahl, que puideron desenvolver un protocolo de centrifugación en gradiente de densidade para illar o ADN da bacteria E. coli, xa que demostraron a replicación semiconservativa do ADN durante o seu experimento de 1958.
Técnicas de extracción de ácidos nucleicos
Cales son as 4 etapas da extracción de ADN?
Todos os métodos de extracción resúmense nos mesmos pasos fundamentais.
Interrupción celularEsta etapa, tamén coñecida como lise celular, implica a rotura da parede celular e/ou da membrana celular para liberar os fluídos intracelulares que conteñen os ácidos nucleicos de interese.
Eliminación de residuos non desexados. Isto inclúe lípidos de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos non desexados que poden interferir coas aplicacións posteriores.
Illamento. Existen varias maneiras diferentes de illar os ácidos nucleicos de interese a partir do lisado purificado que creaches, que se dividen en dúas categorías principais: baseado en solución ou en estado sólido (véxase a seguinte sección).
Concentración. Unha vez illados os ácidos nucleicos de todos os demais contaminantes e diluíntes, preséntanse nun eluato altamente concentrado.
Os dous tipos de extracción
Hai dous tipos de extracción de ácidos nucleicos: os métodos baseados en solución e os métodos en estado sólido. O método baseado en solución tamén se coñece como método de extracción química, xa que implica o uso de produtos químicos para descompoñer a célula e acceder ao material nucleico. Pode empregar compostos orgánicos como o fenol e o cloroformo ou compostos inorgánicos menos nocivos e, polo tanto, máis recomendables, como a proteinase K ou o xel de sílice.
Algúns exemplos de diferentes métodos de extracción química para descompoñer unha célula inclúen:
- Ruptura osmótica da membrana
- Dixestión encimática da parede celular
- Solubilización da membrana
- Con deterxentes
- Con tratamento alcalino
As técnicas de estado sólido, tamén coñecidas como métodos mecánicos, implican aproveitar como o ADN interactúa cun substrato sólido. Ao seleccionar unha esfera ou molécula á que se unirá o ADN pero non o analito, é posible separar as dúas. Algúns exemplos de técnicas de extracción en fase sólida inclúen o uso de sílice e esferas magnéticas.
Explicación da extracción de perlas magnéticas
O método de extracción de perlas magnéticas
O potencial da extracción mediante microesferas magnéticas recoñecéuse por primeira vez nunha patente estadounidense presentada por Trevor Hawkins para a institución de investigación do Whitehead Institute. Esta patente recoñecía que era posible extraer material xenético uníndoo a un soporte sólido, que podería ser unha microesfera magnética. O principio é que se usa unha microesfera magnética altamente funcionalizada á que se unirá o material xenético, que logo se pode separar do sobrenadante aplicando unha forza magnética ao exterior do recipiente que contén a mostra.
Por que usar a extracción con esferas magnéticas?
A tecnoloxía de extracción con esferas magnéticas é cada vez máis frecuente debido ao potencial que ofrece para procedementos de extracción rápidos e eficientes. Nos últimos tempos, desenvolvéronse esferas magnéticas altamente funcionalizadas con sistemas tampón axeitados, o que fixo posible a automatización da extracción de ácidos nucleicos e un fluxo de traballo moi poucos recursos e rendibles. Ademais, os métodos de extracción con esferas magnéticas non implican os pasos de centrifugación que poden causar forzas de cizallamento que rompen anacos de ADN máis longos. Isto significa que as cadeas de ADN máis longas permanecen intactas, o que é importante nas probas xenómicas.
Data de publicación: 25 de novembro de 2022