Introduction
Qu’est-ce que l’extraction d’acide nucléique ?
En termes simples, l'extraction d'acides nucléiques consiste à éliminer l'ARN et/ou l'ADN d'un échantillon, ainsi que tout excédent superflu. Ce processus isole les acides nucléiques d'un échantillon et les produit sous forme d'un éluat concentré, exempt de diluants et de contaminants susceptibles d'affecter les applications ultérieures.
Applications de l'extraction d'acides nucléiques
Les acides nucléiques purifiés sont utilisés dans une multitude d'applications différentes, dans de nombreux secteurs d'activité. Le secteur de la santé est probablement celui où ils sont le plus utilisés, l'ARN et l'ADN purifiés étant nécessaires à de nombreux tests.
Les applications de l’extraction d’acide nucléique dans les soins de santé comprennent :
- Séquençage de nouvelle génération (NGS)
- Génotypage SNP basé sur l'amplification
- Génotypage basé sur des tableaux
- Digestion par enzymes de restriction
- Analyses utilisant des enzymes de modification (par exemple, ligature et clonage)
Il existe également d’autres domaines au-delà des soins de santé où l’extraction d’acide nucléique est utilisée, notamment, mais sans s’y limiter, les tests de paternité, la médecine légale et la génomique.
Une brève histoire de l'extraction d'acide nucléique
extraction d'ADNL'origine de l'ADN remonte à loin, la première isolation connue ayant été réalisée par un médecin suisse nommé Friedrich Miescher en 1869. Miescher espérait résoudre les principes fondamentaux de la vie en déterminant la composition chimique des cellules. Après avoir échoué avec les lymphocytes, il parvint à obtenir un précipité brut d'ADN à partir de leucocytes trouvés dans du pus sur des pansements abandonnés. Il y parvint en ajoutant de l'acide, puis de l'alcali, à la cellule pour la séparer du cytoplasme, puis développa un protocole pour séparer l'ADN des autres protéines.
Suite aux recherches révolutionnaires de Miescher, de nombreux autres scientifiques ont continué à développer des techniques d'isolement et de purification de l'ADN. Edwin Joseph Cohn, spécialiste des protéines, a développé de nombreuses techniques de purification des protéines pendant la Seconde Guerre mondiale. Il a été responsable de l'isolement de la fraction d'albumine sérique du plasma sanguin, essentielle au maintien de la pression osmotique dans les vaisseaux sanguins. Cet élément était crucial pour maintenir les soldats en vie.
En 1953, Francis Crick, en collaboration avec Rosalind Franklin et James Watson, a déterminé la structure de l'ADN, montrant qu'il était constitué de deux brins de longues chaînes de nucléotides d'acide nucléique. Cette découverte révolutionnaire a ouvert la voie à Meselson et Stahl, qui ont pu développer un protocole de centrifugation par gradient de densité pour isoler l'ADN de la bactérie E. coli, démontrant la réplication semi-conservative de l'ADN lors de leur expérience de 1958.
Techniques d'extraction d'acide nucléique
Quelles sont les 4 étapes de l’extraction de l’ADN ?
Toutes les méthodes d’extraction se résument aux mêmes étapes fondamentales.
Perturbation cellulaire. Cette étape, également appelée lyse cellulaire, consiste à briser la paroi cellulaire et/ou la membrane cellulaire, afin de libérer les fluides intracellulaires contenant les acides nucléiques d'intérêt.
Élimination des débris indésirables. Cela inclut les lipides membranaires, les protéines et autres acides nucléiques indésirables qui peuvent interférer avec les applications en aval.
Isolement. Il existe plusieurs méthodes pour isoler les acides nucléiques d'intérêt à partir du lysat purifié que vous avez créé. Ces méthodes se répartissent en deux grandes catégories : en solution ou à l'état solide (voir section suivante).
Concentration. Une fois les acides nucléiques isolés de tous les autres contaminants et diluants, ils sont présentés dans un éluat hautement concentré.
Les deux types d'extraction
Il existe deux types d'extraction d'acide nucléique : les méthodes en solution et les méthodes en milieu solide. La méthode en solution est également appelée extraction chimique, car elle utilise des produits chimiques pour décomposer la cellule et accéder au matériel nucléique. Il peut s'agir de composés organiques comme le phénol et le chloroforme, ou de composés inorganiques moins nocifs et donc plus recommandés comme la protéinase K ou le gel de silice.
Voici quelques exemples de différentes méthodes d’extraction chimique pour décomposer une cellule :
- Rupture osmotique de la membrane
- Digestion enzymatique de la paroi cellulaire
- Solubilisation de la membrane
- Avec des détergents
- Avec traitement alcalin
Les techniques à l'état solide, également appelées méthodes mécaniques, exploitent l'interaction de l'ADN avec un substrat solide. En sélectionnant une bille ou une molécule sur laquelle l'ADN se lie, mais pas l'analyte, il est possible de séparer les deux. Exemples de techniques d'extraction en phase solide : utilisation de billes de silice et de billes magnétiques.
L'extraction par billes magnétiques expliquée
La méthode d'extraction par billes magnétiques
Le potentiel d'extraction à l'aide de billes magnétiques a été reconnu pour la première fois dans un brevet américain déposé par Trevor Hawkins, pour le compte de l'Institut Whitehead. Ce brevet reconnaissait la possibilité d'extraire du matériel génétique en le liant à un support solide, qui pourrait être une bille magnétique. Le principe est d'utiliser une bille magnétique hautement fonctionnalisée sur laquelle le matériel génétique se fixe, puis est séparé du surnageant par application d'une force magnétique à l'extérieur du récipient contenant l'échantillon.
Pourquoi utiliser l’extraction par billes magnétiques ?
La technologie d'extraction par billes magnétiques gagne en popularité, en raison de son potentiel pour des procédures d'extraction rapides et efficaces. Récemment, des billes magnétiques hautement fonctionnalisées, associées à des systèmes tampons adaptés, ont été développées, permettant l'automatisation de l'extraction des acides nucléiques et un flux de travail très économe en ressources et rentable. De plus, les méthodes d'extraction par billes magnétiques évitent les étapes de centrifugation, susceptibles de provoquer des forces de cisaillement susceptibles de fragmenter les fragments d'ADN plus longs. Ainsi, les brins d'ADN plus longs restent intacts, ce qui est important pour les tests génomiques.
Date de publication : 25 novembre 2022