استخراج اسید نوکلئیک و روش مهره مغناطیسی

مقدمه

استخراج اسید نوکلئیک چیست؟

به ساده‌ترین بیان، استخراج اسید نوکلئیک عبارت است از حذف RNA و/یا DNA از یک نمونه و تمام موارد اضافی غیر ضروری. فرآیند استخراج، اسیدهای نوکلئیک را از یک نمونه جدا کرده و آنها را به شکل یک محلول غلیظ، عاری از رقیق‌کننده‌ها و آلاینده‌هایی که می‌توانند بر هرگونه کاربرد پایین‌دستی تأثیر بگذارند، ارائه می‌دهد.

کاربردهای استخراج اسید نوکلئیک

اسیدهای نوکلئیک خالص‌شده در طیف وسیعی از کاربردهای مختلف، در صنایع مختلف، مورد استفاده قرار می‌گیرند. شاید حوزه مراقبت‌های بهداشتی بیشترین کاربرد را داشته باشد و RNA و DNA خالص‌شده برای طیف وسیعی از اهداف آزمایش مورد نیاز است.

کاربردهای استخراج اسید نوکلئیک در مراقبت‌های بهداشتی عبارتند از:

- تکثیر PCR و qPCR

- توالی‌یابی نسل بعدی (NGS)

- ژنوتیپ SNP مبتنی بر تکثیر

- ژنوتیپ مبتنی بر آرایه

- هضم آنزیمی محدودکننده

- آنالیزهایی با استفاده از آنزیم‌های اصلاح‌کننده (مثلاً لیگاسیون و کلونینگ)

همچنین زمینه‌های دیگری فراتر از مراقبت‌های بهداشتی وجود دارد که در آنها از استخراج اسید نوکلئیک استفاده می‌شود، از جمله اما نه محدود به آزمایش تعیین نسب، پزشکی قانونی و ژنومیک.

تاریخچه مختصری از استخراج اسید نوکلئیک

استخراج DNAقدمت این روش به گذشته‌های بسیار دور برمی‌گردد، به طوری که اولین جداسازی شناخته شده توسط یک پزشک سوئیسی به نام فردریش میشر در سال ۱۸۶۹ انجام شد. میشر امیدوار بود با تعیین ترکیب شیمیایی سلول‌ها، اصول اساسی حیات را حل کند. پس از شکست در مورد لنفوسیت‌ها، او توانست رسوب خام DNA را از لکوسیت‌های موجود در چرک روی بانداژهای دور ریخته شده به دست آورد. او این کار را با اضافه کردن اسید و سپس قلیا به سلول برای خروج از سیتوپلاسم سلول انجام داد و سپس پروتکلی برای جداسازی DNA از سایر پروتئین‌ها تدوین کرد.

پس از تحقیقات پیشگامانه میشر، بسیاری از دانشمندان دیگر به پیشرفت و توسعه تکنیک‌هایی برای جداسازی و خالص‌سازی DNA پرداختند. ادوین جوزف کوهن، دانشمند پروتئین، تکنیک‌های زیادی را برای خالص‌سازی پروتئین در طول جنگ جهانی دوم توسعه داد. او مسئول جداسازی بخش آلبومین سرم از پلاسمای خون بود که در حفظ فشار اسمزی در رگ‌های خونی مهم است. این امر برای زنده نگه داشتن سربازان بسیار مهم بود.

در سال ۱۹۵۳، فرانسیس کریک به همراه روزالیند فرانکلین و جیمز واتسون، ساختار DNA را تعیین کردند و نشان دادند که از دو رشته زنجیره طولانی نوکلئوتیدهای اسید نوکلئیک تشکیل شده است. این کشف غیرمنتظره، راه را برای مزلسون و استال هموار کرد که توانستند یک پروتکل سانتریفیوژ گرادیان چگالی برای جداسازی DNA از باکتری E. coli ایجاد کنند، زیرا آنها در آزمایش سال ۱۹۵۸ خود، تکثیر نیمه حفاظتی DNA را نشان دادند.

تکنیک‌های استخراج اسید نوکلئیک

۴ مرحله استخراج DNA چیست؟
همه روش‌های استخراج به مراحل اساسی یکسانی خلاصه می‌شوند.

اختلال سلولیاین مرحله که به عنوان لیز سلولی نیز شناخته می‌شود، شامل تجزیه دیواره سلولی و/یا غشای سلولی است تا مایعات درون سلولی حاوی اسیدهای نوکلئیک مورد نظر آزاد شوند.

حذف بقایای ناخواسته. این شامل لیپیدهای غشایی، پروتئین‌ها و سایر اسیدهای نوکلئیک ناخواسته است که می‌توانند در کاربردهای بعدی اختلال ایجاد کنند.

جداسازی. روش‌های مختلفی برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مورد نظر از لیزات شفافی که ایجاد کرده‌اید وجود دارد که به دو دسته اصلی تقسیم می‌شوند: محلول یا حالت جامد (به بخش بعدی مراجعه کنید).

غلظت. پس از اینکه اسیدهای نوکلئیک از سایر آلاینده‌ها و رقیق‌کننده‌ها جدا شدند، در یک محلول بسیار غلیظ ارائه می‌شوند.

دو نوع استخراج
دو نوع استخراج اسید نوکلئیک وجود دارد - روش‌های مبتنی بر محلول و روش‌های حالت جامد. روش مبتنی بر محلول همچنین به عنوان روش استخراج شیمیایی شناخته می‌شود، زیرا شامل استفاده از مواد شیمیایی برای تجزیه سلول و دسترسی به مواد نوکلئیک است. این روش می‌تواند یا با استفاده از ترکیبات آلی مانند فنل و کلروفرم یا ترکیبات معدنی کم‌ضررتر و در نتیجه توصیه‌شده‌تر مانند پروتئیناز K یا ژل سیلیکا انجام شود.

نمونه‌هایی از روش‌های مختلف استخراج شیمیایی برای تجزیه سلول عبارتند از:

- پارگی اسمزی غشاء

- هضم آنزیمی دیواره سلولی

- انحلال‌پذیری غشاء

- با مواد شوینده

- با عملیات قلیایی

تکنیک‌های حالت جامد، که به عنوان روش‌های مکانیکی نیز شناخته می‌شوند، شامل بهره‌برداری از چگونگی برهمکنش DNA با یک بستر جامد است. با انتخاب یک مهره یا مولکولی که DNA به آن متصل می‌شود اما آنالیت به آن متصل نمی‌شود، می‌توان این دو را از هم جدا کرد. نمونه‌هایی از تکنیک‌های استخراج فاز جامد شامل استفاده از مهره‌های سیلیس و مغناطیسی است.

استخراج با مهره مغناطیسی توضیح داده شد

روش استخراج با مهره مغناطیسی
پتانسیل استخراج با استفاده از مهره‌های مغناطیسی اولین بار در یک اختراع ثبت شده در ایالات متحده توسط ترور هاوکینز، برای موسسه تحقیقاتی وایت‌هد، شناسایی شد. این اختراع اذعان داشت که می‌توان مواد ژنتیکی را با اتصال آنها به یک حامل پشتیبان جامد، که می‌تواند یک مهره مغناطیسی باشد، استخراج کرد. اصل این است که شما از یک مهره مغناطیسی بسیار عامل‌دار استفاده می‌کنید که ماده ژنتیکی به آن متصل می‌شود و سپس می‌توان با اعمال نیروی مغناطیسی به قسمت بیرونی ظرف حاوی نمونه، آن را از مایع رویی جدا کرد.

چرا از استخراج با مهره مغناطیسی استفاده کنیم؟
فناوری استخراج با مهره مغناطیسی به دلیل پتانسیلی که برای روش‌های استخراج سریع و کارآمد دارد، به طور فزاینده‌ای رایج می‌شود. در سال‌های اخیر، پیشرفت‌هایی در زمینه مهره‌های مغناطیسی با عملکرد بالا و سیستم‌های بافر مناسب حاصل شده است که امکان اتوماسیون استخراج اسید نوکلئیک و گردش کاری بسیار سبک و مقرون به صرفه را فراهم کرده است. همچنین، روش‌های استخراج با مهره مغناطیسی شامل مراحل سانتریفیوژ که می‌تواند باعث ایجاد نیروهای برشی شود که قطعات طولانی‌تر DNA را تجزیه می‌کنند، نمی‌شوند. این بدان معناست که رشته‌های طولانی‌تر DNA دست نخورده باقی می‌مانند، که در آزمایش‌های ژنومیک مهم است.