Sarrera
Zer da azido nukleikoaren erauzketa?
Hitz sinpleenetan esanda, azido nukleikoaren erauzketa lagin batetik RNA eta/edo DNA kentzea da, eta beharrezkoa ez den soberakin guztia. Erauzketa prozesuak azido nukleikoak lagin batetik isolatzen ditu eta eluatu kontzentratu moduan lortzen ditu, ondorengo aplikazioetan eragina izan dezaketen diluitzailerik eta kutsatzailerik gabe.
Azido nukleikoen erauzketaren aplikazioak
Azido nukleiko purifikatuak aplikazio ugaritan erabiltzen dira, hainbat industriatan zehar. Osasungintza da, agian, gehien erabiltzen den arloa, RNA eta DNA purifikatuak hainbat proba-helburutarako behar baitira.
Azido nukleikoen erauzketaren aplikazioen artean, osasungintzan honako hauek daude:
- Hurrengo Belaunaldiko Sekuentziazioa (NGS)
- Anplifikazioan oinarritutako SNP genotipatzea
- Matrizeetan oinarritutako genotipatzea
- Murrizketa-entzimen bidezko digestioa
- Entzima aldatzaileak erabiliz egindako analisiak (adibidez, ligadura eta klonazioa)
Osasungintzatik haratago doaz beste arlo batzuk ere badaude, non azido nukleikoaren erauzketa erabiltzen den, besteak beste, aitatasun probak, auzitegi-medikuntza eta genomika.
Azido nukleikoaren erauzketaren historia laburra
DNA erauzketaAspalditik dator, ezagutzen den lehenengo isolamendua Friedrich Miescher izeneko suitzar medikuak egin baitzuen 1869an. Miescherrek bizitzaren oinarrizko printzipioak zelulen konposizio kimikoa zehaztuz konpondu nahi zituen. Linfozitoekin huts egin ondoren, baztertutako bendetako pusean aurkitutako leukozitoetatik DNA prezipitatu gordin bat lortu ahal izan zuen. Horretarako, azidoa eta gero alkalia gehitu zizkion zelulari zelularen zitoplasmatik irteteko, eta ondoren protokolo bat garatu zuen DNA beste proteinetatik bereizteko.
Miescherren ikerketa iraultzaileen ondoren, beste zientzialari askok aurrera egin eta garatu dituzte DNA isolatu eta arazteko teknikak. Edwin Joseph Cohn proteina-zientzialariak proteinak arazteko teknika asko garatu zituen Bigarren Mundu Gerran. Odol-plasmaren albumina serikoaren frakzioa isolatzeaz arduratu zen, eta hori garrantzitsua da odol-hodietan presio osmotikoa mantentzeko. Hau funtsezkoa zen soldaduak bizirik mantentzeko.
1953an, Francis Crickek, Rosalind Franklin eta James Watsonekin batera, DNAren egitura zehaztu zuen, azido nukleikoen nukleotidoen bi kate luzez osatuta zegoela erakutsiz. Aurkikuntza berri honek bidea ireki zien Meselsoni eta Stahli, zeinek dentsitate-gradiente zentrifugazio protokolo bat garatu ahal izan zuten E. coli bakterioetatik DNA isolatzeko, 1958ko esperimentuan DNAren erreplikazio erdi-kontserbadorea frogatu baitzuten.
Azido nukleikoak erauzteko teknikak
Zeintzuk dira DNA erauzteko 4 etapak?
Erauzketa-metodo guztiak oinarrizko urrats berberetara laburbiltzen dira.
Zelulen hausturaEtapa honek, zelulen lisi gisa ere ezagutzen denak, zelula-horma eta/edo zelula-mintza haustea dakar, intereseko azido nukleikoak dituzten zelula barneko fluidoak askatzeko.
Nahi gabeko hondakinen kentzea. Honen barruan mintzeko lipidoak, proteinak eta nahi gabeko beste azido nukleiko batzuk daude, eta horiek ondorengo aplikazioetan eragin dezakete.
Isolamendua. Hainbat modu daude interesatzen zaizkizun azido nukleikoak sortutako lisatu garbitutik isolatzeko, bi kategoria nagusitan sailkatuta: disoluzioan oinarritutakoak edo egoera solidoan oinarritutakoak (ikus hurrengo atala).
Kontzentrazioa. Azido nukleikoak beste kutsatzaile eta diluitzaile guztietatik isolatu ondoren, eluatu oso kontzentratu batean aurkezten dira.
Bi erauzketa motak
Bi motatako azido nukleikoak erauzteko metodoak daude: disoluzioan oinarritutako metodoak eta egoera solidoan oinarritutako metodoak. Disoluzioan oinarritutako metodoa erauzketa kimikoaren metodoa bezala ere ezagutzen da, zelula deskonposatzeko eta material nukleikora sartzeko produktu kimikoak erabiltzean datzalako. Horretarako, konposatu organikoak erabil daitezke, hala nola fenola eta kloroformoa, edo kalte gutxiagoko eta, beraz, gomendagarriagoak diren konposatu ez-organikoak, hala nola Proteinasa K edo silize gela.
Zelula bat deskonposatzeko erauzketa kimikoko metodo desberdinen adibideak hauek dira:
- Mintzaren haustura osmotikoa
- Zelula-hormaren digestio entzimatikoa
- Mintzaren disolbagarritasuna
- Detergenteekin.
- Alkali tratamenduarekin
Egoera solidoko teknikak, metodo mekaniko gisa ere ezagunak, DNAk substratu solido batekin nola elkarreragiten duen ustiatzen dute. DNAk baina analitoak ez lotuko den ale edo molekula bat hautatuz, biak bereiz daitezke. Fase solidoko erauzketa tekniken adibideen artean, silizea eta ale magnetikoak erabiltzea dago.
Ale magnetikoen erauzketa azalduta
Ale magnetikoak erauzteko metodoa
Ale magnetikoak erabiliz erauzteko potentziala lehen aldiz Trevor Hawkinsek Whitehead Institutuko ikerketa-erakundearentzat aurkeztutako AEBetako patente batean aitortu zen. Patente honek onartzen zuen material genetikoa ateratzea posible zela euskarri solido bati lotuz, ale magnetiko bat izan zitekeena. Printzipioa da material genetikoa lotuko den ale magnetiko oso funtzionalizatu bat erabiltzea, eta ondoren, lagina duen ontziaren kanpoaldean indar magnetiko bat aplikatuz gainnadantetik bereiz daitekeena.
Zergatik erabili ale magnetikoen erauzketa?
Ale magnetikoen erauzketa teknologia gero eta hedatuagoa da, erauzketa prozedura azkar eta eraginkorretarako duen potentzialagatik. Azken aldian, funtzionalitate handiko ale magnetikoak garatu dira buffer sistema egokiekin, eta horrek azido nukleikoaren erauzketa automatizatzea eta baliabide gutxiko eta kostu-eraginkorra den lan-fluxua ahalbidetu du. Gainera, ale magnetikoen erauzketa metodoek ez dute DNA zati luzeagoak hausten dituzten zizaila-indarrak eragin ditzaketen zentrifugazio-urratsik behar. Horrek esan nahi du DNA kate luzeagoak osorik mantentzen direla, eta hori garrantzitsua da genomika probetan.
Argitaratze data: 2022ko azaroaren 25a