Sissejuhatus
Mis on nukleiinhappe ekstraheerimine?
Lihtsamalt öeldes on nukleiinhapete ekstraheerimine RNA ja/või DNA ning kogu mittevajaliku eemaldamine proovist. Ekstraheerimisprotsess isoleerib nukleiinhapped proovist ja annab need kontsentreeritud eluaadi kujul, mis on vaba lahjendusainetest ja saasteainetest, mis võiksid mõjutada mis tahes järgnevaid rakendusi.
Nukleiinhappe ekstraheerimise rakendused
Puhastatud nukleiinhappeid kasutatakse paljudes erinevates rakendustes, mis ulatuvad mitmetesse eri tööstusharudesse. Tervishoid on ehk valdkond, kus seda kõige rohkem kasutatakse, kusjuures puhastatud RNA-d ja DNA-d on vaja paljude erinevate testimise eesmärkide jaoks.
Nukleiinhapete ekstraheerimise rakendused tervishoius hõlmavad järgmist:
- Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS)
- Amplifikatsioonil põhinev SNP genotüüpimine
- Massiivipõhine genotüüpimine
- Restriktsioonensüümide seedimine
- Modifitseerivate ensüümide abil tehtavad analüüsid (nt ligeerimine ja kloonimine)
Lisaks tervishoiule on ka teisi valdkondi, kus nukleiinhapete ekstraheerimist kasutatakse, sealhulgas, kuid mitte ainult, isaduse testimine, kohtuekspertiis ja genoomika.
Nukleiinhapete ekstraheerimise lühiajalugu
DNA ekstraheerimineulatub kaugele minevikku, kusjuures esimese teadaoleva isoleerimise viis läbi Šveitsi arst nimega Friedrich Miescher 1869. aastal. Miescher lootis elu põhiprintsiipe lahendada rakkude keemilise koostise määramise abil. Pärast lümfotsüütidega ebaõnnestumist suutis ta saada DNA toorpretsipitaadi leukotsüütidest, mida leiti äravisatud sidemete mädast. Ta tegi seda, lisades rakku hapet ja seejärel leelist, et see raku tsütoplasmast lahkuks, ning seejärel töötas välja protokolli DNA eraldamiseks teistest valkudest.
Pärast Miescheri murrangulist uurimistööd on paljud teised teadlased edasi arendanud ja arendanud DNA eraldamise ja puhastamise meetodeid. Valguteadlane Edwin Joseph Cohn töötas Teise maailmasõja ajal välja palju valkude puhastamise meetodeid. Ta vastutas vereplasma seerumi albumiinifraktsiooni eraldamise eest, mis on oluline veresoonte osmootse rõhu säilitamiseks. See oli sõdurite elushoidmiseks ülioluline.
1953. aastal määras Francis Crick koos Rosalind Franklini ja James Watsoniga DNA struktuuri, näidates, et see koosneb kahest pikast nukleiinhapete nukleotiidide ahelast. See läbimurdeline avastus sillutas teed Meselsonile ja Stahlile, kes suutsid välja töötada tihedusgradiendi tsentrifuugimise protokolli DNA eraldamiseks E. coli bakteritest, demonstreerides oma 1958. aasta eksperimendi käigus DNA poolkonservatiivset replikatsiooni.
Nukleiinhappe ekstraheerimise tehnikad
Millised on DNA ekstraheerimise 4 etappi?
Kõik ekstraheerimismeetodid taanduvad samadele põhietappidele.
Rakkude häiredSee etapp, tuntud ka kui rakulüüs, hõlmab rakuseina ja/või rakumembraani lagundamist, et vabastada huvipakkuvaid nukleiinhappeid sisaldavad rakusisesed vedelikud.
Soovimatu prahi eemaldamine. See hõlmab membraanilipiide, valke ja muid soovimatuid nukleiinhappeid, mis võivad häirida allavoolu rakendusi.
Isoleerimine. Huvipakkuvate nukleiinhapete isoleerimiseks loodud puhastatud lüsaadist on mitu erinevat viisi, mis jagunevad kahte põhikategooriasse: lahusel põhinev või tahke olek (vt järgmist jaotist).
Kontsentratsioon. Pärast nukleiinhapete eraldamist kõikidest muudest saasteainetest ja lahjendusainetest esitatakse need kõrgelt kontsentreeritud eluaadis.
Kaks ekstraheerimise tüüpi
Nukleiinhapete ekstraheerimist on kahte tüüpi – lahusel põhinevad meetodid ja tahkefaasilised meetodid. Lahusel põhinevat meetodit tuntakse ka keemilise ekstraheerimise meetodina, kuna see hõlmab kemikaalide kasutamist rakkude lagundamiseks ja nukleiinmaterjalile juurdepääsuks. Selleks võib kasutada kas orgaanilisi ühendeid, nagu fenool ja kloroform, või vähem kahjulikke ja seetõttu soovitatavamaid anorgaanilisi ühendeid, nagu proteinaas K või silikageel.
Rakkude lagundamiseks mõeldud erinevate keemiliste ekstraheerimismeetodite näited hõlmavad järgmist:
- Membraani osmootne purunemine
- Rakuseina ensümaatiline seedimine
- Membraani lahustumine
- Pesuvahenditega
- Leelisega töötlemisel
Tahkisefaasi meetodid, tuntud ka kui mehaanilised meetodid, hõlmavad DNA ja tahke substraadi interaktsiooni ärakasutamist. Valides helme või molekuli, millega DNA seondub, kuid analüüt mitte, on võimalik need kaks eraldada. Tahkisefaasi ekstraheerimistehnikate näited hõlmavad ränidioksiidi ja magnethelmeste kasutamist.
Magnetiliste helmeste ekstraheerimise selgitus
Magnetiliste helmeste ekstraheerimise meetod
Magnetiliste pärlite abil ekstraheerimise potentsiaali tunnistati esmakordselt USA patendis, mille esitas Trevor Hawkins Whiteheadi Instituudi uurimisasutusele. See patent tunnistas, et geneetilist materjali on võimalik ekstraheerida, sidudes selle tahkele kandeainele, milleks võib olla magnetiline pärl. Põhimõte seisneb selles, et kasutatakse kõrgfunktsionaliseeritud magnetilist pärli, millele geneetiline materjal seondub, ja seejärel saab selle supernatandist eraldada, rakendades proovi sisaldava anuma välisküljele magnetjõudu.
Miks kasutada magnethelmeste ekstraheerimist?
Magnetiliste pärlite ekstraheerimise tehnoloogia on muutumas üha levinumaks tänu potentsiaalile kiireteks ja tõhusateks ekstraheerimisprotseduurideks. Viimasel ajal on välja töötatud sobivate puhversüsteemidega kõrgelt funktsionaliseeritud magnetilisi pärleid, mis on võimaldanud nukleiinhapete ekstraheerimise automatiseerimist ning väga ressursisäästlikku ja kulutõhusat töövoogu. Samuti ei hõlma magnetiliste pärlite ekstraheerimise meetodid tsentrifuugimisetappe, mis võivad põhjustada nihkejõude, mis lõhuvad pikemaid DNA tükke. See tähendab, et pikemad DNA ahelad jäävad terveks, mis on oluline genoomika testimisel.
Postituse aeg: 25. november 2022