Enkonduko
Kio estas Nuklea Acida Ekstraktado?
En la plej simpla termino, nukleaacida ekstraktado estas la forigo de RNA kaj/aŭ DNA el specimeno kaj la tuta superflua superfluo. La procezo de ekstraktado izolas la nukleajn acidojn el specimeno kaj produktas ilin en la formo de koncentrita eluato, libera de diluiloj kaj poluaĵoj, kiuj povus influi iujn ajn postajn aplikojn.
Aplikoj de Nukleacida Ekstraktado
Purigitaj nukleaj acidoj estas uzataj en abundo da diversaj aplikoj, ampleksantaj plurajn malsamajn industriojn. Sanservo estas eble la areo kie ĝi estas plej uzata, kun purigita RNA kaj DNA necesaj por amaso da diversaj testaj celoj.
Aplikoj de nukleaacida ekstraktado en sanservo inkluzivas:
- Sekva Generacia Sekvencado (NGS)
- Amplifikado-bazita SNP-Genotipado
- Aro-bazita Genotipado
- Digestado per Restriktaj Enzimoj
- Analizoj uzante Modifantajn Enzimojn (ekz. Ligaturo kaj Klonado)
Ekzistas ankaŭ aliaj kampoj preter sanservo kie nukleaacida ekstraktado estas uzata, inkluzive de sed ne limigite al patrecotestado, krimmedicino kaj genomiko.
Mallonga Historio de Nuklea Acida Ekstraktado
DNA-ekstraktadodatiĝas de tre longe, kaj la unua konata izolado estis farita de svisa kuracisto nomita Friedrich Miescher en 1869. Miescher esperis solvi la fundamentajn principojn de vivo per determinado de la kemia konsisto de ĉeloj. Post malsukceso kun limfocitoj, li sukcesis akiri krudan precipitaĵon de DNA el leŭkocitoj trovitaj en puso sur forĵetitaj bandaĝoj. Li faris tion per aldono de acido kaj poste alkalo al la ĉelo por forlasi la ĉelcitoplasmon, kaj poste evoluigis protokolon por apartigi la DNA-on de la aliaj proteinoj.
Sekvante la pioniran esploradon de Miescher, multaj aliaj sciencistoj daŭrigis antaŭenigi kaj evoluigi teknikojn por izoli kaj purigi DNA-on. Edwin Joseph Cohn, proteinsciencisto, evoluigis multajn teknikojn por proteinpurigo dum la Dua Mondmilito. Li respondecis pri izolado de la seruma albumina frakcio de sangoplasmo, kiu gravas por konservi la osmozan premon en la sangaj vaskuloj. Ĉi tio estis decida por teni soldatojn vivaj.
En 1953 Francis Crick, kune kun Rosalind Franklin kaj James Watson, determinis la strukturon de DNA, montrante ke ĝi konsistas el du fadenoj de longaj ĉenoj de nukleaacidaj nukleotidoj. Ĉi tiu mirinda malkovro pavimis la vojon por Meselson kaj Stahl, kiuj sukcesis disvolvi densecgradientan centrifugan protokolon por izoli DNA-on de E. coli-bakterioj, ĉar ili montris la duonkonservativan replikadon de DNA dum sia eksperimento de 1958.
Teknikoj de Nukleacida Ekstraktado
Kiuj estas la 4 etapoj de DNA-ekstraktado?
Ĉiuj ekstraktaj metodoj reduktiĝas al la samaj fundamentaj paŝoj.
Ĉela InterrompoĈi tiu etapo, ankaŭ konata kiel ĉellizo, implikas la malkonstruon de la ĉelmuro kaj/aŭ la ĉelmembrano, por liberigi la intraĉelajn fluidojn enhavantajn la nukleajn acidojn de intereso.
Forigo de Nedezirataj Derompaĵoj. Tio inkluzivas membranajn lipidojn, proteinojn kaj aliajn nedeziratajn nukleajn acidojn, kiuj povas interrompi postajn aplikojn.
Izolado. Ekzistas pluraj malsamaj manieroj izoli la interesajn nukleajn acidojn el la kreita purigita lizato, kiuj falas inter du ĉefajn kategoriojn: solvaĵaj aŭ solidaj (vidu la sekvan sekcion).
Koncentriĝo. Post kiam la nukleaj acidoj estas izolitaj de ĉiuj aliaj poluaĵoj kaj diluiloj, ili estas prezentitaj en tre koncentrita eluato.
La Du Tipoj de Ekstraktado
Ekzistas du tipoj de nukleaacida ekstraktado - solvaĵaj metodoj kaj solidstataj metodoj. La solvaĵa metodo ankaŭ konatas kiel kemia ekstrakta metodo, ĉar ĝi implikas la uzon de kemiaĵoj por malkonstrui la ĉelon kaj aliri la nuklean materialon. Tio povas esti uzante aŭ organikajn kombinaĵojn kiel fenolo kaj kloroformo, aŭ la malpli damaĝajn kaj tial pli rekomendindajn neorganikajn kombinaĵojn kiel Proteinazo K aŭ silika ĝelo.
Ekzemploj de malsamaj kemiaj ekstraktaj metodoj por malkonstrui ĉelon inkluzivas:
- Osmoza krevo de membrano
- Enzima digestado de ĉelmuroj
- Solvigo de membrano
- Kun lesivoj
- Kun alkala traktado
Solidstataj teknikoj, ankaŭ konataj kiel mekanikaj metodoj, implikas ekspluati kiel DNA interagas kun solida substrato. Elektante globeton aŭ molekulon, al kiu la DNA ligiĝos sed la analito ne, eblas apartigi la du. Ekzemploj de solidfazaj ekstraktaj teknikoj inkluzivas la uzon de siliciaj kaj magnetaj globetoj.
Klarigo pri Magneta Perl-Ekstraktado
La Magneta Perlo-Ekstraktado-Metodo
La potencialo por ekstraktado uzante magnetajn globetojn unue estis agnoskita en usona patento registrita de Trevor Hawkins por la esplorinstitucio Whitehead Institute. Ĉi tiu patento agnoskis, ke eblas ekstrakti genetikan materialon per ligado de ĝi al solida subtenilo, kiu povus esti magneta globeto. La principo estas, ke oni uzas altfunkciigitan magnetan globeton, al kiu la genetika materialo ligiĝos, kiu poste povas esti apartigita de la supernatanto per aplikado de magneta forto al la ekstero de la ujo enhavanta la specimenon.
Kial Uzi Magnetan Perlan Ekstraktadon?
Magneta perloekstraktado fariĝas pli kaj pli ofta, pro la potencialo, kiun ĝi havas por rapidaj kaj efikaj ekstraktaj proceduroj. Lastatempe okazis disvolviĝoj de altfunkciigitaj magnetaj perloj kun taŭgaj bufrosistemoj, kiuj ebligis aŭtomatigon de nukleaacida ekstraktado kaj laborfluon, kiu estas tre rimedo-malmultekosta kaj kostefika. Ankaŭ, magnetaj perloekstraktado-metodoj ne implikas la centrifugajn paŝojn, kiuj povas kaŭzi tondajn fortojn, kiuj rompas pli longajn pecojn de DNA. Tio signifas, ke pli longaj fadenoj de DNA restas sendifektaj, kio estas grava en genomikaj testoj.
Afiŝtempo: 25-a de novembro 2022