Nukleinsäureextraktion und die Magnetic Bead-Methode

Einführung

Was ist Nukleinsäureextraktion?

Vereinfacht ausgedrückt handelt es sich bei der Nukleinsäureextraktion um die Entfernung von RNA und/oder DNA aus einer Probe sowie aller nicht benötigten Reste. Der Extraktionsprozess isoliert die Nukleinsäuren aus der Probe und liefert sie als konzentriertes Eluat, frei von Verdünnungsmitteln und Verunreinigungen, die nachfolgende Anwendungen beeinträchtigen könnten.

Anwendungen der Nukleinsäureextraktion

Gereinigte Nukleinsäuren werden in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen in verschiedenen Branchen eingesetzt. Der Gesundheitswesenbereich ist wohl der am häufigsten genutzte Bereich, da gereinigte RNA und DNA für eine Vielzahl unterschiedlicher Testzwecke benötigt werden.

Zu den Anwendungen der Nukleinsäureextraktion im Gesundheitswesen gehören:

- PCR- und qPCR-Amplifikation

- Sequenzierung der nächsten Generation (NGS)

- Amplifikationsbasierte SNP-Genotypisierung

- Array-basierte Genotypisierung

- Restriktionsenzymverdauung

- Analysen mit modifizierenden Enzymen (zB Ligation und Klonierung)

Auch außerhalb des Gesundheitswesens kommt die Nukleinsäureextraktion in anderen Bereichen zum Einsatz, beispielsweise bei Vaterschaftstests, in der Forensik und in der Genomik.

Eine kurze Geschichte der Nukleinsäureextraktion

DNA-ExtraktionDie DNA-Isolation reicht weit zurück. Die erste bekannte Isolierung gelang dem Schweizer Arzt Friedrich Miescher im Jahr 1869. Miescher hoffte, die Grundlagen des Lebens durch die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Zellen zu entschlüsseln. Nach einem Misserfolg mit Lymphozyten gelang es ihm, einen groben DNA-Niederschlag aus Leukozyten zu gewinnen, die er im Eiter von weggeworfenen Verbänden fand. Dazu gab er zunächst Säure und dann Lauge in die Zelle, um das Zytoplasma der Zelle zu erhalten. Anschließend entwickelte er ein Protokoll zur Trennung der DNA von den anderen Proteinen.

Nach Mieschers bahnbrechender Forschung entwickelten viele andere Wissenschaftler Techniken zur Isolierung und Reinigung von DNA. Der Proteinforscher Edwin Joseph Cohn entwickelte während des Zweiten Weltkriegs zahlreiche Techniken zur Proteinreinigung. Er war verantwortlich für die Isolierung des Serumalbuminanteils des Blutplasmas, der für die Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks in den Blutgefäßen wichtig ist. Dies war entscheidend für das Überleben von Soldaten.

1953 entschlüsselten Francis Crick, Rosalind Franklin und James Watson die Struktur der DNA und zeigten, dass sie aus zwei Strängen langer Nukleinsäureketten besteht. Diese bahnbrechende Entdeckung ebnete den Weg für Meselson und Stahl, die ein Dichtegradientenzentrifugationsprotokoll zur Isolierung von DNA aus E. coli-Bakterien entwickelten. In ihrem Experiment von 1958 demonstrierten sie die semikonservative DNA-Replikation.

Techniken der Nukleinsäureextraktion

Was sind die 4 Schritte der DNA-Extraktion?
Alle Extraktionsmethoden lassen sich auf die gleichen grundlegenden Schritte reduzieren.

ZellzerstörungIn diesem Stadium, das auch als Zelllyse bezeichnet wird, werden die Zellwand und/oder die Zellmembran aufgebrochen, um die intrazellulären Flüssigkeiten freizusetzen, die die gewünschten Nukleinsäuren enthalten.

Entfernung unerwünschter Rückstände. Dazu gehören Membranlipide, Proteine ​​und andere unerwünschte Nukleinsäuren, die nachfolgende Anwendungen beeinträchtigen können.

Isolierung. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die gewünschten Nukleinsäuren aus dem von Ihnen erstellten geklärten Lysat zu isolieren. Diese lassen sich in zwei Hauptkategorien einteilen: lösungsbasiert oder in festem Zustand (siehe nächsten Abschnitt).

Konzentrierung. Nachdem die Nukleinsäuren von allen anderen Verunreinigungen und Verdünnungsmitteln isoliert wurden, liegen sie in einem hochkonzentrierten Eluat vor.

Die zwei Arten der Extraktion
Es gibt zwei Arten der Nukleinsäureextraktion: lösungsbasierte Methoden und Feststoffmethoden. Die lösungsbasierte Methode wird auch als chemische Extraktionsmethode bezeichnet, da sie Chemikalien verwendet, um die Zelle aufzubrechen und das Nukleinmaterial freizusetzen. Dies kann entweder mit organischen Verbindungen wie Phenol und Chloroform oder mit den weniger schädlichen und daher empfohlenen anorganischen Verbindungen wie Proteinase K oder Kieselgel geschehen.

Beispiele für verschiedene chemische Extraktionsmethoden zum Aufbrechen einer Zelle sind:

- Osmotischer Membranbruch

- Enzymatische Verdauung der Zellwand

- Solubilisierung der Membran

- Mit Reinigungsmitteln

- Mit Alkalibehandlung

Festkörpertechniken, auch mechanische Methoden genannt, nutzen die Wechselwirkung von DNA mit einem festen Substrat. Durch die Auswahl eines Kügelchens oder Moleküls, an das die DNA bindet, der Analyt jedoch nicht, können beide Substanzen getrennt werden. Beispiele für Festphasenextraktionstechniken sind die Verwendung von Silicagel und magnetischen Kügelchen.

Magnetische Kügelchenextraktion erklärt

Die Magnetkügelchen-Extraktionsmethode
Das Potenzial der Extraktion mit magnetischen Beads wurde erstmals in einem US-Patent von Trevor Hawkins für das Whitehead Institute erkannt. Dieses Patent bestätigte die Möglichkeit, genetisches Material durch Bindung an einen festen Träger, beispielsweise einen magnetischen Bead, zu extrahieren. Das Prinzip besteht darin, einen hochfunktionalisierten magnetischen Bead zu verwenden, an den das genetische Material bindet. Dieser kann dann durch Anlegen einer magnetischen Kraft an die Außenseite des Probengefäßes vom Überstand getrennt werden.

Warum die Extraktion mit magnetischen Kügelchen verwenden?
Die Extraktionstechnologie mit magnetischen Beads gewinnt aufgrund ihres Potenzials für schnelle und effiziente Extraktionsverfahren zunehmend an Bedeutung. In jüngster Zeit wurden hochfunktionalisierte magnetische Beads mit geeigneten Puffersystemen entwickelt, die eine Automatisierung der Nukleinsäureextraktion und einen ressourcenschonenden und kosteneffizienten Arbeitsablauf ermöglichen. Zudem entfallen bei der Extraktion mit magnetischen Beads die Zentrifugationsschritte, die Scherkräfte verursachen und längere DNA-Stücke zerteilen können. Dadurch bleiben längere DNA-Stränge intakt, was für genomische Tests wichtig ist.