Extracció d'àcids nucleics i el mètode de perles magnètiques

Introducció

Què és l'extracció d'àcids nucleics?

En termes molt senzills, l'extracció d'àcids nucleics és l'eliminació de l'ARN i/o l'ADN d'una mostra i de tot l'excés que no és necessari. El procés d'extracció aïlla els àcids nucleics d'una mostra i els produeix en forma d'un eluat concentrat, lliure de diluents i contaminants que podrien afectar qualsevol aplicació posterior.

Aplicacions de l'extracció d'àcids nucleics

Els àcids nucleics purificats s'utilitzen en una gran quantitat d'aplicacions diferents, que abasten múltiples indústries diferents. L'atenció mèdica és potser l'àrea on més s'utilitza, ja que l'ARN i l'ADN purificats són necessaris per a una gran varietat de propòsits de prova diferents.

Les aplicacions de l'extracció d'àcids nucleics en l'atenció mèdica inclouen:

- Amplificació per PCR i qPCR

- Seqüenciació de Nova Generació (NGS)

- Genotipificació de SNP basada en l'amplificació

- Genotipatge basat en matrius

- Digestió amb enzims de restricció

- Anàlisis mitjançant enzims modificadors (per exemple, lligació i clonació)

També hi ha altres camps més enllà de l'atenció mèdica on s'utilitza l'extracció d'àcids nucleics, com ara les proves de paternitat, la medicina forense i la genòmica.

Una breu història de l'extracció d'àcids nucleics

Extracció d'ADNes remunta a molt de temps, i el primer aïllament conegut va ser realitzat per un metge suís anomenat Friedrich Miescher el 1869. Miescher esperava resoldre els principis fonamentals de la vida determinant la composició química de les cèl·lules. Després de fallar amb els limfòcits, va poder obtenir un precipitat cru d'ADN de leucòcits trobats en pus de benes descartades. Ho va fer afegint àcid i després àlcali a la cèl·lula perquè sortís del citoplasma de la cèl·lula, i després va desenvolupar un protocol per separar l'ADN de les altres proteïnes.

Després de la recerca innovadora de Miescher, molts altres científics han avançat i desenvolupat tècniques per aïllar i purificar l'ADN. Edwin Joseph Cohn, un científic de proteïnes, va desenvolupar moltes tècniques per a la purificació de proteïnes durant la Segona Guerra Mundial. Va ser el responsable d'aïllar la fracció d'albúmina sèrica del plasma sanguini, que és important per mantenir la pressió osmòtica als vasos sanguinis. Això era crucial per mantenir els soldats vius.

El 1953, Francis Crick, juntament amb Rosalind Franklin i James Watson, van determinar l'estructura de l'ADN, demostrant que estava format per dues cadenes llargues de nucleòtids d'àcid nucleic. Aquest descobriment innovador va preparar el camí per a Meselson i Stahl, que van poder desenvolupar un protocol de centrifugació en gradient de densitat per aïllar l'ADN del bacteri E. coli, ja que van demostrar la replicació semiconservativa de l'ADN durant el seu experiment de 1958.

Tècniques d'extracció d'àcids nucleics

Quines són les 4 etapes de l'extracció d'ADN?
Tots els mètodes d'extracció es redueixen als mateixos passos fonamentals.

Disrupció cel·lularAquesta etapa, també coneguda com a lisi cel·lular, implica la ruptura de la paret cel·lular i/o la membrana cel·lular per tal d'alliberar els fluids intracel·lulars que contenen els àcids nucleics d'interès.

Eliminació de residus no desitjats. Això inclou lípids de membrana, proteïnes i altres àcids nucleics no desitjats que poden interferir amb les aplicacions posteriors.

Aïllament. Hi ha diverses maneres d'aïllar els àcids nucleics d'interès del lisat clarificat que heu creat, que es divideixen en dues categories principals: basat en solucions o en estat sòlid (vegeu la secció següent).

Concentració. Després que els àcids nucleics s'hagin aïllat de tots els altres contaminants i diluents, es presenten en un eluat altament concentrat.

Els dos tipus d'extracció
Hi ha dos tipus d'extracció d'àcids nucleics: els mètodes basats en solucions i els mètodes en estat sòlid. El mètode basat en solucions també es coneix com a mètode d'extracció química, ja que implica l'ús de productes químics per descompondre la cèl·lula i accedir al material nucleic. Pot ser utilitzant compostos orgànics com el fenol i el cloroform, o compostos inorgànics menys nocius i, per tant, més recomanats, com la proteinasa K o el gel de sílice.

Exemples de diferents mètodes d'extracció química per descompondre una cèl·lula inclouen:

- Ruptura osmòtica de la membrana

- Digestió enzimàtica de la paret cel·lular

- Solubilització de la membrana

- Amb detergents

- Amb tractament alcalí

Les tècniques d'estat sòlid, també conegudes com a mètodes mecànics, consisteixen a explotar com l'ADN interactua amb un substrat sòlid. Seleccionant una perla o molècula a la qual s'unirà l'ADN però no l'analit, és possible separar-les. Exemples de tècniques d'extracció en fase sòlida inclouen l'ús de sílice i perles magnètiques.

Explicació de l'extracció de perles magnètiques

El mètode d'extracció de perles magnètiques
El potencial d'extracció mitjançant perles magnètiques es va reconèixer per primera vegada en una patent nord-americana presentada per Trevor Hawkins per a la institució de recerca del Whitehead Institute. Aquesta patent reconeixia que era possible extreure material genètic unint-lo a un suport sòlid, que podria ser una perla magnètica. El principi és que s'utilitza una perla magnètica altament funcionalitzada a la qual s'uneix el material genètic, que després es pot separar del sobrenedant aplicant una força magnètica a l'exterior del recipient que conté la mostra.

Per què utilitzar l'extracció amb perles magnètiques?
La tecnologia d'extracció amb perles magnètiques és cada cop més prevalent, a causa del potencial que ofereix per a procediments d'extracció ràpids i eficients. En els darrers temps, s'han desenvolupat perles magnètiques altament funcionalitzades amb sistemes tampó adequats, que han fet possible l'automatització de l'extracció d'àcids nucleics i un flux de treball molt econòmic i amb pocs recursos. A més, els mètodes d'extracció amb perles magnètiques no impliquen els passos de centrifugació que poden causar forces de cisallament que trenquen trossos d'ADN més llargs. Això significa que les cadenes d'ADN més llargues romanen intactes, cosa que és important en les proves genòmiques.