Uvod
Šta je ekstrakcija nukleinskih kiselina?
Najjednostavnije rečeno, ekstrakcija nukleinskih kiselina je uklanjanje RNK i/ili DNK iz uzorka i svih nepotrebnih dijelova. Proces ekstrakcije izoluje nukleinske kiseline iz uzorka i daje ih u obliku koncentrovanog eluata, bez razređivača i kontaminanata koji bi mogli uticati na bilo koju naknadnu primjenu.
Primjena ekstrakcije nukleinskih kiselina
Pročišćene nukleinske kiseline se koriste u mnoštvu različitih primjena, u različitim industrijama. Zdravstvo je možda područje gdje se najviše koriste, pri čemu su pročišćena RNK i DNK potrebne za niz različitih testiranja.
Primjene ekstrakcije nukleinskih kiselina u zdravstvu uključuju:
- Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS)
- SNP genotipizacija zasnovana na amplifikaciji
- Genotipizacija zasnovana na nizovima
- Digestija restrikcijskim enzimima
- Analize korištenjem modificirajućih enzima (npr. ligacija i kloniranje)
Postoje i druga područja izvan zdravstva gdje se koristi ekstrakcija nukleinskih kiselina, uključujući, ali ne ograničavajući se na testiranje očinstva, forenziku i genomiku.
Kratka historija ekstrakcije nukleinskih kiselina
Ekstrakcija DNKdatira daleko u prošlost, a prvu poznatu izolaciju izvršio je švicarski ljekar Friedrich Miescher 1869. godine. Miescher se nadao da će riješiti temeljne principe života određivanjem hemijskog sastava ćelija. Nakon neuspjeha s limfocitima, uspio je dobiti sirovi talog DNK iz leukocita pronađenih u gnoju na odbačenim zavojima. To je učinio dodavanjem kiseline, a zatim alkalije u ćeliju kako bi napustio citoplazmu ćelije, a zatim je razvio protokol za odvajanje DNK od ostalih proteina.
Nakon Miescherovog revolucionarnog istraživanja, mnogi drugi naučnici su nastavili s razvojem tehnika za izolaciju i pročišćavanje DNK. Edwin Joseph Cohn, naučnik za proteine, razvio je mnoge tehnike za pročišćavanje proteina tokom Drugog svjetskog rata. Bio je odgovoran za izolaciju frakcije serumskog albumina u krvnoj plazmi, koja je važna za održavanje osmotskog pritiska u krvnim sudovima. Ovo je bilo ključno za održavanje života vojnika.
Godine 1953. Francis Crick je, zajedno s Rosalind Franklin i Jamesom Watsonom, odredio strukturu DNK, pokazujući da se sastoji od dva lanca dugih lanaca nukleinskih kiselina i nukleotida. Ovo revolucionarno otkriće utrlo je put Meselsonu i Stahlu, koji su uspjeli razviti protokol centrifugiranja u gradijentu gustoće za izolaciju DNK iz bakterije E. coli, demonstrirajući polukonzervativnu replikaciju DNK tokom svog eksperimenta iz 1958. godine.
Tehnike ekstrakcije nukleinskih kiselina
Koje su 4 faze ekstrakcije DNK?
Sve metode ekstrakcije svode se na iste osnovne korake.
Poremećaj ćelijaOva faza, poznata i kao ćelijska liza, uključuje razgradnju ćelijskog zida i/ili ćelijske membrane, kako bi se oslobodile intracelularne tečnosti koje sadrže nukleinske kiseline od interesa.
Uklanjanje neželjenih ostataka. To uključuje membranske lipide, proteine i druge neželjene nukleinske kiseline koje mogu ometati daljnje primjene.
Izolacija. Postoji niz različitih načina za izolaciju nukleinskih kiselina od interesa iz pročišćenog lizata koji ste kreirali, a koji spadaju u dvije glavne kategorije: na bazi rastvora ili u čvrstom stanju (vidi sljedeći odjeljak).
Koncentracija. Nakon što su nukleinske kiseline izolirane od svih ostalih kontaminanata i razrjeđivača, one se prezentiraju u visoko koncentriranom eluatu.
Dvije vrste ekstrakcije
Postoje dvije vrste ekstrakcije nukleinskih kiselina - metode zasnovane na rastvoru i metode u čvrstom stanju. Metoda zasnovana na rastvoru poznata je i kao metoda hemijske ekstrakcije, jer uključuje upotrebu hemikalija za razgradnju ćelije i pristup nukleinskom materijalu. To se može učiniti korištenjem organskih spojeva poput fenola i kloroforma ili manje štetnih i stoga preporučenijih neorganskih spojeva poput proteinaze K ili silika gela.
Primjeri različitih metoda hemijske ekstrakcije za razgradnju ćelije uključuju:
- Osmotsko pucanje membrane
- Enzimska digestija ćelijskog zida
- Solubilizacija membrane
- S deterdžentima
- Sa tretmanom alkalija
Tehnike čvrstog stanja, poznate i kao mehaničke metode, uključuju iskorištavanje načina na koji DNK interaguje sa čvrstom podlogom. Odabirom kuglice ili molekule na koju će se DNK vezati, ali analit neće, moguće je razdvojiti ta dva. Primjeri tehnika ekstrakcije u čvrstoj fazi uključuju korištenje silicijum dioksida i magnetnih kuglica.
Objašnjenje ekstrakcije magnetskih kuglica
Metoda ekstrakcije magnetskim kuglicama
Potencijal za ekstrakciju korištenjem magnetskih kuglica prvi put je prepoznat u američkom patentu koji je podnio Trevor Hawkins za istraživačku instituciju Whitehead Institute. Ovaj patent je priznao da je moguće ekstrahirati genetski materijal vezivanjem za čvrsti nosač, koji može biti magnetska kuglica. Princip je da se koristi visoko funkcionalizirana magnetska kuglica na koju će se vezati genetski materijal, koji se zatim može odvojiti od supernatanta primjenom magnetske sile na vanjsku stranu posude koja drži uzorak.
Zašto koristiti ekstrakciju magnetskih kuglica?
Tehnologija ekstrakcije magnetskim kuglicama postaje sve rasprostranjenija, zbog potencijala koji ima za brze i efikasne postupke ekstrakcije. U posljednje vrijeme razvijene su visoko funkcionalizirane magnetske kuglice s odgovarajućim puferskim sistemima, što je omogućilo automatizaciju ekstrakcije nukleinskih kiselina i tijek rada koji je vrlo efikasan u pogledu resursa i troškova. Također, metode ekstrakcije magnetskim kuglicama ne uključuju korake centrifugiranja koji mogu uzrokovati sile smicanja koje razbijaju duže dijelove DNK. To znači da duži lanci DNK ostaju netaknuti, što je važno u genomskom testiranju.
Vrijeme objave: 25. novembar 2022.