Kako pipetirati majhne količine z ročnimi pipetami

Ker se vedno več pozornosti posveča zmanjševanju reagentov in stroškov, so manjši volumni zelo povpraševani, npr. za pripravo PCR Mastermix ali encimskih reakcij. Vendar pa pipetiranje majhnih volumnov od 0,2 do 5 µL postavlja nove izzive za natančnost in preciznost pipetiranja. Bistvene so naslednje točke:

1. Velikost pipete in konice: Vedno izberite pipeto z najmanjšo možno nominalno prostornino in najmanjšo konico, da bo zračna blazina čim manjša. Pri pipetiranju npr. 1 µL izberite pipeto s prostornino 0,25–2,5 µL in ustrezno konico, namesto pipete s prostornino 1–10 µL.
2. Kalibracija in vzdrževanje: Bistveno je, da so vaše pipete pravilno kalibrirane in vzdrževane. Majhne nastavitve in zlomljeni deli na pipeti povzročijo veliko povečanje sistematičnih in naključnih napak. Kalibracijo v skladu s standardom ISO 8655 je treba izvesti enkrat letno.
3. Pipete s pozitivnim izpodrivanjem: Preverite, ali imate v laboratoriju pipeto s pozitivnim izpodrivanjem z majhnim obsegom volumna. Na splošno uporaba te vrste pipete vodi do boljšega rezultata pipetiranja v smislu natančnosti in preciznosti kot pri klasičnih pipetah z zračno blazino.
4. Poskusite uporabiti večje količine: Razmislite o redčenju vzorca, da boste s pipeto odmerili večje količine z enako količino v končni reakciji. To lahko zmanjša napake pri pipetiranju pri zelo majhnih količinah vzorcev.

Poleg dobrega orodja mora imeti raziskovalec tudi zelo dobro tehniko pipetiranja. Posebno pozornost posvetite naslednjim korakom:

1. Pritrditev konice: Pipete ne pritiskajte na konico, saj lahko s tem poškodujete tanko konico, kar povzroči preusmeritev curka tekočine ali poškodbo odprtine. Pri nameščanju konice pritiskajte le rahlo in uporabljajte pipeto z vzmetnim stožcem.
2. Držanje pipete: Med čakanjem na centrifugo, cikler itd. pipete ne držite v roki. Notranjost pipete se bo segrela in povzročila širjenje zračne blazine, kar bo povzročilo odstopanja od nastavljene prostornine med pipetiranjem.
3. Predhodno vlaženje: Vlaženje zraka v konici in pipeti pripravi konico na vzorec in prepreči izhlapevanje pri aspiraciji prenesenega volumna.
4. Vertikalna aspiracija: To je zelo pomembno pri ravnanju z majhnimi količinami, da se izognemo kapilarnemu učinku, ki nastane, ko pipeto držimo pod kotom.
5. Globina potopitve: Konico potopite čim manj, da preprečite vdor tekočine vanjo zaradi kapilarnega učinka. Pravilo: Manjša kot je konica in njen volumen, manjša je globina potopitve. Pri pipetiranju majhnih volumnov priporočamo največ 2 mm.
6. Doziranje pod kotom 45°: Optimalen pretok tekočine je zagotovljen, če pipeto držite pod kotom 45°.
7. Stik s steno posode ali površino tekočine: Majhne količine je mogoče pravilno odmeriti le, če je konica držana ob steni posode ali potopljena v tekočino. Tudi zadnja kapljica s konice se lahko natančno odmeri.
8. Izpihovanje: Po izpihovanju majhnih količin je obvezno izpihovanje, da se odstrani tudi zadnja kapljica tekočine, ki je prisotna v konici. Izpihovanje je treba izvesti tudi ob steni posode. Pazite, da pri izpihovanju na površini tekočine v vzorec ne vnesete zračnih mehurčkov.