Slik pipetterer du små volumer med håndholdte manuelle pipetter

Etter hvert som det legges mer fokus på å redusere reagenser og kostnader, er mindre volumer etterspurt, f.eks. for fremstilling av PCR Mastermix eller enzymreaksjoner. Men pipettering av små volumer fra 0,2–5 µL gir nye utfordringer for pipetteringsnøyaktighet og presisjon. Følgende punkter er viktige:

1. Pipette- og spissstørrelse: Velg alltid pipetten med lavest mulig nominelt volum og minste spiss for å holde luftputen så liten som mulig. Når du pipetterer f.eks. 1 µL, velg en 0,25–2,5 µL pipette og matchende spiss i stedet for en 1–10 µL pipette.
2. Kalibrering og vedlikehold: Det er viktig at pipettene dine er riktig kalibrert og vedlikeholdt. Små justeringer og ødelagte deler på en pipette fører til en massiv økning i systematiske og tilfeldige feilverdier. En kalibrering i henhold til ISO 8655 må utføres én gang i året.
3. Positive fortrengningspipetter: Sjekk om du har en positiv fortrengningspipette med lavt volumområde i laboratoriet ditt. Generelt sett fører bruk av denne typen pipette til et bedre pipetteringsresultat når det gjelder nøyaktighet og presisjon enn med klassiske luftputepipetter.
4. Prøv å bruke større volumer: Du kan vurdere å fortynne prøven for å pipettere større volumer med samme mengde i den endelige reaksjonen. Dette kan redusere pipetteringsfeil med svært små prøvevolumer.

I tillegg til et godt verktøy, må forskeren ha en svært god pipetteringsteknikk. Vær spesielt oppmerksom på følgende trinn:

1. Spissfeste: Ikke klem pipetten fast på spissen, da dette kan skade den fine spissen, føre til at væskestrålen blir omdirigert eller skade åpningen. Trykk kun lett når du fester en spiss, og bruk en pipette med fjærbelastet spisskjegle.
2. Holde pipetten: Ikke hold pipetten i hånden mens du venter på sentrifugen, sykleren osv. Innsiden av pipetten vil varmes opp og føre til at luftputen utvider seg, noe som resulterer i avvik fra det innstilte volumet ved pipettering.
3. Forfukting: Fuktingen av luften inne i spissen og pipetten forbereder spissen for prøven og unngår fordampning ved aspirering av overføringsvolumet.
4. Vertikal aspirasjon: Dette er svært viktig ved håndtering av små volumer for å unngå kapillæreffekten som oppstår når pipetten holdes i en vinkel.
5. Neddykkingsdybde: Senk spissen så lite som mulig for å forhindre at væske kommer inn i spissen på grunn av kapillæreffekten. Tommelfingerregel: Jo mindre spiss og volum, desto lavere neddykkingsdybde. Vi anbefaler maksimalt 2 mm ved pipettering av små volumer.
6. Dispensering i 45° vinkel: Optimal utstrømning av væsken garanteres når pipetten holdes i en 45° vinkel.
7. Kontakt med karveggen eller væskeoverflaten: Små volumer kan bare dispenseres riktig når spissen holdes mot karveggen eller senkes ned i væske. Selv den siste dråpen fra spissen kan dispenseres nøyaktig.
8. Utblåsning: En utblåsning er obligatorisk etter dispensering av lave volumer for å dispensere selv den siste dråpen væske som er igjen i spissen. Utblåsningen bør også utføres mot beholderveggen. Vær forsiktig så du ikke bringer luftbobler inn i prøven når du utfører en utblåsning på væskeoverflaten.