Kako pipetirati male količine ručnim pipetama

Kako se sve više naglaska stavlja na smanjenje reagensa i troškova, manji volumeni su vrlo traženi, npr. za pripremu PCR Mastermixa ili enzimskih reakcija. No, pipetiranje malih volumena od 0,2 – 5 µL postavlja nove izazove za točnost i preciznost pipetiranja. Sljedeće točke su bitne:

1. Veličina pipete i vrha: Uvijek birajte pipetu s najmanjim mogućim nominalnim volumenom i najmanjim vrhom kako biste zračni jastuk održali što manjim. Prilikom pipetiranja npr. 1 µL, odaberite pipetu od 0,25 – 2,5 µL i odgovarajući vrh, a ne pipetu od 1 – 10 µL.
2. Kalibracija i održavanje: Bitno je da su vaše pipete pravilno kalibrirane i održavane. Male prilagodbe i slomljeni dijelovi na pipeti dovode do masovnog povećanja sustavnih i slučajnih pogrešaka. Kalibracija prema normi ISO 8655 mora se provoditi jednom godišnje.
3. Pipete s pozitivnim istiskivanjem: Provjerite imate li u laboratoriju pipetu s pozitivnim istiskivanjem s malim rasponom volumena. Općenito, korištenje ove vrste pipete dovodi do boljih rezultata pipetiranja u smislu točnosti i preciznosti nego s klasičnim pipetama sa zračnim jastukom.
4. Pokušajte koristiti veće volumene: Možete razmisliti o razrjeđivanju uzorka kako biste pipetirali veće volumene s istom količinom u konačnoj reakciji. To može smanjiti pogreške pipetiranja s vrlo malim volumenima uzoraka.

Osim dobrog alata, istraživač mora imati vrlo dobru tehniku ​​pipetiranja. Obratite posebnu pozornost na sljedeće korake:

1. Pričvršćivanje vrha: Nemojte pritiskati pipetu na vrh jer to može oštetiti fini vrh, uzrokovati preusmjeravanje mlaza tekućine ili oštetiti otvor. Prilikom pričvršćivanja vrha primjenjujete samo lagani pritisak i koristite pipetu s konusnim vrhom s oprugom.
2. Držanje pipete: Nemojte držati pipetu u ruci dok čekate centrifugu, cikler itd. Unutrašnjost pipete će se zagrijati i uzrokovati širenje zračnog jastuka što će rezultirati odstupanjima od zadanog volumena prilikom pipetiranja.
3. Prethodno vlaženje: Vlaženje zraka unutar vrha i pipete priprema vrh za uzorak i sprječava isparavanje prilikom aspiracije prenesenog volumena.
4. Vertikalna aspiracija: Ovo je vrlo važno pri rukovanju malim volumenima kako bi se izbjegao kapilarni efekt koji se javlja kada se pipeta drži pod kutom.
5. Dubina uranjanja: Vrh uronite što je manje moguće kako biste spriječili ulazak tekućine u vrh zbog kapilarnog efekta. Pravilo: Što je manji vrh i volumen, to je manja dubina uranjanja. Preporučujemo maksimalno 2 mm pri pipetiranju malih volumena.
6. Doziranje pod kutom od 45°: Optimalno istjecanje tekućine zajamčeno je kada se pipeta drži pod kutom od 45°.
7. Kontakt sa stijenkom posude ili površinom tekućine: Mali volumeni mogu se pravilno dozirati samo kada se vrh drži uz stijenku posude ili uroni u tekućinu. Čak se i posljednja kap s vrha može precizno dozirati.
8. Ispuhivanje: Ispuhivanje je obavezno nakon ispuštanja malih količina kako bi se istisnula i posljednja kap tekućine prisutna u vrhu. Ispuhivanje također treba provoditi uz stijenku posude. Pazite da ne unesete mjehuriće zraka u uzorak prilikom ispuhivanja na površini tekućine.