Jak pipetovat malé objemy pomocí ručních manuálních pipet

Vzhledem k tomu, že se klade větší důraz na snižování počtu činidel a nákladů, je vysoká poptávka po menších objemech, např. pro přípravu PCR Mastermixu nebo enzymatických reakcí. Pipetování malých objemů od 0,2 do 5 µl však představuje nové výzvy pro přesnost a preciznost pipetování. Následující body jsou nezbytné:

1. Velikost pipety a špičky: Vždy volte pipetu s co nejnižším nominálním objemem a nejmenší špičkou, aby byl vzduchový polštář co nejmenší. Při pipetování např. 1 µl zvolte pipetu o objemu 0,25–2,5 µl a odpovídající špičku, spíše než pipetu o objemu 1–10 µl.
2. Kalibrace a údržba: Je nezbytné, aby vaše pipety byly správně kalibrovány a udržovány. Malé úpravy a rozbité součásti na pipetě vedou k masivnímu nárůstu hodnot systematických a náhodných chyb. Kalibrace podle normy ISO 8655 musí být provedena jednou ročně.
3. Objemové pipety: Zkontrolujte, zda máte ve své laboratoři objemovou pipetu s nízkým objemovým rozsahem. Obecně platí, že použití tohoto typu pipety vede k lepším výsledkům pipetování z hlediska přesnosti a preciznosti než u klasických pipet se vzduchovým polštářem.
4. Zkuste použít větší objemy: Můžete zvážit ředění vzorku, abyste pipetovali větší objemy se stejným množstvím v konečné reakci. To může snížit chyby pipetování u velmi malých objemů vzorků.

Kromě dobrého nástroje musí mít výzkumník i velmi dobrou pipetovací techniku. Zvláštní pozornost věnujte následujícím krokům:

1. Upevnění hrotu: Nepřitlačujte pipetu k hrotu, mohlo by dojít k poškození jemného konce hrotu, což by mohlo vést k přesměrování paprsku kapaliny nebo k poškození otvoru. Při nasazování hrotu tlačte pouze lehce a používejte pipetu s pružinovým kuželem hrotu.
2. Držení pipety: Nedržte pipetu v ruce, zatímco čekáte na centrifugu, cykler atd. Vnitřek pipety se zahřeje a způsobí roztažení vzduchového polštáře, což povede k odchylkám od nastaveného objemu při pipetování.
3. Předvlhčení: Zvlhčení vzduchu uvnitř špičky a pipety připraví špičku pro vzorek a zabrání odpařování při nasávání přeneseného objemu.
4. Vertikální aspirace: To je velmi důležité při manipulaci s malými objemy, aby se zabránilo kapilárnímu efektu, ke kterému dochází, když je pipeta držena pod úhlem.
5. Hloubka ponoru: Ponořte špičku co nejméně, aby se zabránilo vniknutí kapaliny do špičky v důsledku kapilárního efektu. Základní pravidlo: Čím menší je špička a objem, tím menší je hloubka ponoru. Při pipetování malých objemů doporučujeme maximálně 2 mm.
6. Dávkování pod úhlem 45°: Optimální odtok kapaliny je zaručen, když je pipeta držena pod úhlem 45°.
7. Kontakt se stěnou nádoby nebo povrchem kapaliny: Malé objemy lze správně dávkovat pouze tehdy, když je hrot přitisknut ke stěně nádoby nebo ponořen do kapaliny. I poslední kapka z hrotu může být přesně dávkována.
8. Profouknutí: Po nadávkování malých objemů je nutné provést profouknutí, aby se odstranila i poslední kapka kapaliny přítomné v trysce. Profouknutí by mělo být provedeno také proti stěně nádoby. Při profouknutí hladiny kapaliny dbejte na to, aby se do vzorku nevnesly vzduchové bubliny.