Kriovialepërdoren zakonisht për ruajtjen kriogjenike të linjave qelizore dhe materialeve të tjera kritike biologjike, në enë dewar të mbushura me azot të lëngshëm.

Ka disa faza të përfshira në ruajtjen me sukses të qelizave në azot të lëngshëm. Ndërsa parimi bazë është ngrirja e ngadaltë, teknika e saktë e përdorur varet nga lloji i qelizës dhe krioprotekenti i përdorur. Ka disa konsiderata sigurie dhe praktika më të mira që duhen marrë në konsideratë kur ruhen qelizat në temperatura kaq të ulëta.

Ky postim synon të japë një pasqyrë të përgjithshme se si ruhen kriovialet në azot të lëngshëm.

Çfarë janë Kriovialet

Kriovialet janë shishe të vogla me kapak, të projektuara për ruajtjen e mostrave të lëngshme në temperatura jashtëzakonisht të ulëta. Ato sigurojnë që qelizat e ruajtura në krioprotektues të mos vijnë në kontakt të drejtpërdrejtë me azotin e lëngshëm, duke minimizuar rrezikun e thyerjeve qelizore, ndërkohë që përfitojnë ende nga efekti ekstrem ftohës i azotit të lëngshëm.

Shishet zakonisht janë të disponueshme në një gamë vëllimesh dhe dizenjosh - ato mund të jenë të filetuara nga brenda ose nga jashtë me fund të sheshtë ose të rrumbullakosur. Gjithashtu janë të disponueshme formate sterile dhe josterile.

Kush përdorCyrovialspër të ruajtur qelizat në azot të lëngshëm

Një gamë e gjerë laboratorësh të NHS-së dhe laboratorësh privatë, si dhe institucione kërkimore të specializuara në ruajtjen e gjakut të kordonit kërthizor, biologjinë e qelizave epiteliale, imunologjinë dhe biologjinë e qelizave staminale përdorin krioviale për të krioprezervuar qelizat.

Qelizat e ruajtura në këtë mënyrë përfshijnë qelizat B dhe T, qelizat CHO, qelizat staminale hematopoietike dhe qelizat paraardhëse, hibridomat, qelizat intestinale, makrofagët, qelizat staminale mezenkimale dhe qelizat paraardhëse, monocitet, mielomën, qelizat NK dhe qelizat staminale pluripotente.

Përmbledhje e mënyrës së ruajtjes së kriovialeve në azot të lëngshëm

Krio-konservimi është një proces që ruan qelizat dhe konstruktet e tjera biologjike duke i ftohur ato në temperatura shumë të ulëta. Qelizat mund të ruhen në azot të lëngshëm për vite me radhë pa humbur qëndrueshmërinë e qelizave. Ky është një skicë e procedurave të përdorura.

Përgatitja e qelizave

Metoda e saktë për përgatitjen e mostrave do të ndryshojë në varësi të llojit të qelizës, por në përgjithësi, qelizat mblidhen dhe centrifugohen për të zhvilluar një pelet të pasur me qeliza. Ky pelet më pas resuspendohet në supernatantin e përzier me krioprotektues ose një medium kriokonservimi.

Medium krioprezervimi

Ky medium përdoret për të ruajtur qelizat në mjediset me temperaturë të ulët ndaj të cilave ato do të ekspozohen duke penguar formimin e kristaleve intra dhe jashtëqelizore dhe rrjedhimisht vdekjen e qelizave. Roli i tyre është të sigurojnë një mjedis të sigurt dhe mbrojtës për qelizat dhe indet gjatë proceseve të ngrirjes, ruajtjes dhe shkrirjes.

Një medium si plazma e ngrirë e freskët (FFP), tretësira plazmalite e heparinizuar ose tretësira pa serum dhe pa përbërës shtazorë përzihet me krioprotektorë si dimetil sulfoksid (DMSO) ose glicerol.

Peleta e mostrës së ri-lëngëzuar ndahet në krioviale polipropileni si p.sh.Kompania Suzhou Ace Biomedical për Ruajtje Kriogjenike Shishe.

Është e rëndësishme të mos i mbushni shumë kriovialet pasi kjo do të rrisë rrezikun e çarjes dhe lëshimin e mundshëm të përmbajtjes (1).

Shkalla e Ngrirjes së Kontrolluar

Në përgjithësi, një shpejtësi ngrirjeje e ngadaltë dhe e kontrolluar përdoret për krioprezervimin e suksesshëm të qelizave.

Pasi mostrat ndahen në shishe kriogjenike, ato vendosen në akull të lagësht ose në një frigorifer 4℃ dhe procedura e ngrirjes fillon brenda 5 minutave. Si udhëzues i përgjithshëm, qelizat ftohen me një shpejtësi prej -1 deri në -3 në minutë (2). Kjo arrihet duke përdorur një ftohës të programueshëm ose duke vendosur shishet në një kuti të izoluar të vendosur në një frigorifer me shpejtësi të kontrolluar nga –70°C deri në –90°C.

Transferimi në azot të lëngshëm

Shishet kriogjenike të ngrira transferohen më pas në një rezervuar azoti të lëngshëm për periudha të pacaktuara, me kusht që të ruhet një temperaturë më e vogël se -135℃.

Këto temperatura ultra të ulëta mund të arrihen duke u zhytur në azot në fazë të lëngshme ose të avullit.

Fazë e lëngshme apo e avullit?

Ruajtja në azot në fazë të lëngshme dihet se ruan temperaturën e ftohtë me qëndrueshmëri absolute, por shpesh nuk rekomandohet për arsyet e mëposhtme:

• Nevoja për vëllime të mëdha (thellësi) të azotit të lëngshëm, i cili është një rrezik potencial. Djegiet ose asfiksia për shkak të kësaj janë një rrezik real.
• Raste të dokumentuara të kontaminimit të kryqëzuar nga agjentë infektivë si aspergillus, hepatiti B dhe përhapja virale nëpërmjet mjedisit të azotit të lëngshëm (2,3)
• Mundësia që azoti i lëngshëm të rrjedhë në shishe gjatë zhytjes. Kur hiqet nga ruajtja dhe ngrohet në temperaturën e dhomës, azoti zgjerohet me shpejtësi. Si pasojë, shishe mund të thyhet kur hiqet nga ruajtja e azotit të lëngshëm, duke krijuar një rrezik si nga mbeturinat fluturuese ashtu edhe nga ekspozimi ndaj përmbajtjes (1, 4).

Për këto arsye, ruajtja në temperatura ultra të ulëta bëhet më së shpeshti në azot në fazën e avullit. Kur mostrat duhet të ruhen në fazën e lëngshme, duhet të përdoren tuba të specializuara kriofleks.

Ana negative e fazës së avullit është se mund të ndodhë një gradient vertikal i temperaturës që rezulton në luhatje të temperaturës midis -135℃ dhe -190℃. Kjo kërkon monitorim të kujdesshëm dhe të kujdesshëm të niveleve të azotit të lëngshëm dhe ndryshimeve të temperaturës (5).

Shumë prodhues rekomandojnë që kriovialet janë të përshtatshme për ruajtje deri në -135℃ ose për përdorim vetëm në fazën e avullit.

Shkrirja e qelizave tuaja të krioprezervuara

Procedura e shkrirjes është stresuese për një kulturë të ngrirë dhe kërkohet trajtim dhe teknikë e duhur për të siguruar qëndrueshmëri, rikuperim dhe funksionalitet optimal të qelizave. Protokollet e sakta të shkrirjes do të varen nga llojet specifike të qelizave. Megjithatë, shkrirja e shpejtë konsiderohet standarde për:

• Zvogëloni çdo ndikim në rikuperimin qelizor
• Ndihmon në zvogëlimin e kohës së ekspozimit ndaj tretësve të pranishëm në mjedisin e ngrirjes
• Minimizoni çdo dëmtim me anë të rikristalizimit të akullit

Banjot me ujë, banjat me sfera ose instrumentet e specializuara automatike përdoren zakonisht për të shkrirë mostrat.

Më shpesh, 1 linjë qelizore shkrihet në të njëjtën kohë për 1-2 minuta, duke e përzier ngadalë në një banjë uji 37℃ derisa të mbetet vetëm një sasi e vogël akulli në shishe përpara se të lahen në një mjedis rritjeje të parangrohur.

Për disa qeliza, të tilla si embrionet e gjitarëve, ngrohja e ngadaltë është thelbësore për mbijetesën e tyre.

Qelizat tani janë gati për kulturë qelizore, izolim të qelizave ose, në rastin e qelizave staminale hematopoietike, studime të qëndrueshmërisë për të garantuar integritetin e qelizave staminale të donatorëve para terapisë mieloablative.

Është praktikë normale të merren alikuote të vogla të mostrës së parapërgatitur të përdorur për të kryer numërimin e qelizave për të përcaktuar përqendrimet e qelizave për mbjelljen në kulturë. Më pas mund të vlerësoni rezultatet e procedurave të izolimit të qelizave dhe të përcaktoni qëndrueshmërinë e qelizave.

Praktikat më të Mira për Ruajtjen e Kriovialeve

Krioprezervimi i suksesshëm i mostrave të ruajtura në krioviale varet nga shumë elementë në protokoll, duke përfshirë ruajtjen e duhur dhe mbajtjen e të dhënave.

• Ndani qelizat midis vendeve të ruajtjes– Nëse vëllimet e lejojnë, ndani qelizat midis flakoneve dhe ruajini ato në vende të ndara për të zvogëluar rrezikun e humbjes së mostrës për shkak të defekteve të pajisjeve.
• Parandaloni kontaminimin e kryqëzuar– Zgjidhni shishe sterile kriogjenike njëpërdorimshe ose autoklavë para përdorimit të mëvonshëm
• Përdorni shishe me madhësi të përshtatshme për qelizat tuaja– shishet vijnë në një gamë vëllimesh midis 1 dhe 5 ml. Shmangni mbushjen e tepërt të shisheve për të zvogëluar rrezikun e çarjeve.
• Zgjidhni shishe kriogjenike me fileto të brendshme ose të jashtme– Disa universitete rekomandojnë shishe me fileto të brendshme për masa sigurie – ato gjithashtu mund të parandalojnë ndotjen gjatë mbushjes ose kur ruhen në azot të lëngshëm.
• Parandalimi i rrjedhjeve- Përdorni guarnicione me injeksion të dyfishtë të modeluara në kapakun e vidës ose unazat O për të parandaluar rrjedhjen dhe ndotjen.
• Përdorni barkode 2D dhe etiketoni shishet– për të siguruar gjurmueshmërinë, flakonët me sipërfaqe të mëdha shkrimi mundësojnë që çdo flakon të etiketohet në mënyrë të përshtatshme. Barkodet 2D mund të ndihmojnë në menaxhimin e magazinimit dhe mbajtjen e të dhënave. Kapakët me kode ngjyrash janë të dobishëm për identifikim më të lehtë.
• Mirëmbajtje e përshtatshme e magazinimit- Për të siguruar që qelizat të mos humbasin, enët e ruajtjes duhet të monitorojnë vazhdimisht temperaturën dhe nivelet e azotit të lëngshëm. Duhet të instalohen alarme për të njoftuar përdoruesit për gabimet.

Masat paraprake të sigurisë

Azoti i lëngshëm është bërë praktikë e zakonshme në kërkimin modern, por mbart rrezikun e lëndimeve serioze nëse përdoret gabimisht.

Duhet të vishen pajisje mbrojtëse personale (PMP) të përshtatshme për të minimizuar rrezikun e ngrirjes, djegieve dhe incidenteve të tjera të padëshirueshme gjatë trajtimit të azotit të lëngshëm.

• Doreza kriogjenike
• Pallto laboratori
• Mburoja e plotë e fytyrës rezistente ndaj goditjeve që mbulon edhe qafën
• Këpucë me majë të mbyllur
• Përparëse plastike kundër spërkatjeve

Frigoriferët me azot të lëngshëm duhet të vendosen në zona të ajrosura mirë për të minimizuar rrezikun e asfiksisë - azoti i dalë avullon dhe zhvendos oksigjenin atmosferik. Depot me vëllim të madh duhet të kenë sisteme alarmi për oksigjen të ulët.

Puna në çifte kur merret me azot të lëngshëm është ideale dhe përdorimi i tij jashtë orarit normal të punës duhet të ndalohet.

Krioviale për të Mbështetur Rrjedhin Tuaj të Punës

Kompania Suzhou Ace Biomedical ofron një përzgjedhje të gjerë produktesh që plotësojnë nevojat tuaja për krioprezervim për lloje të ndryshme qelizash. Portofoli përfshin një gamë tubash, si dhe një gamë kriovialesh sterile.

Kriovialet tona janë:

• Kapak me vidë laboratori 0.5mL 1.5mL 2.0mL Shishe kriogjenike kriogjenike me fund konik me guarnicion

  ● Specifikime 0.5ml, 1.5ml, 2.0ml, me skaj ose pa skaj
  ● Dizajn konik ose vetëqëndrues, steril ose josteril janë të disponueshëm
  ● Tubat me kapak vidhos janë bërë nga polipropileni i gradës mjekësore
  ● Shishet PP Cryotube mund të ngrihen dhe shkrihen në mënyrë të përsëritur
  ● Dizajni i kapakut të jashtëm mund të zvogëlojë probabilitetin e kontaminimit gjatë trajtimit të mostrës.
  ● Tuba kriogjenike me kapak vidë Fije universale me vidë për përdorim
  ● Tubat përshtaten me shumicën e rotorëve të zakonshëm
  ● Tubat kriogjenikë me unaza o përshtaten me kutitë standarde të ngrirjes 1 inç dhe 2 inç, me 48 puseta, 81 puseta, 96 puseta dhe 100 puseta
  ● I autoklavueshëm deri në 121°C dhe i ngrirë deri në -86°C

  NR. I PJESËS	MATERIALI	VËLLIMI	CAPNGJYRA	PCS/ÇANTË	ÇANTA/KUTI
  ACT05-BL-N	PP	0.5ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1.5ML	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1.5ML	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2.0ml	E zezë, e verdhë, blu, e kuqe, vjollcë, e bardhë	500	10