Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për t'u siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Rëndësia e monitorimit të mostrave mjedisore është vlerësuar shumë që nga fillimi i pandemisë COVID-19 dhe disa përpjekje monitoruese po kryhen duke përdorur standardin e arit, megjithëse teknikat e bazuara në qPCR janë të shtrenjta. Biosensorët elektrokimikë të ADN-së mund të ofrojnë një kosto potencialisht efektive zgjidhje për monitorimin e mostrave mjedisore të ujit në vendet me të ardhura të ulëta dhe të mesme. Në këtë punë, ne demonstrojmë zbulimin elektrokimik të amplikoneve të marra nga fagu Phi6 i izoluar nga mostrat e ujit të liqenit me thumba (një zëvendësues popullor për SARS-CoV-2), duke përdorur ENIG për të kompletuar elektroda PCB pa modifikim të sipërfaqes.seksi. Përgjigja e sensorit elektrokimik u karakterizua tërësisht për dy fragmente të ADN-së me gjatësi të ndryshme (\({117}\,\hbox {bp}\) dhe \({503}\,\hbox {bp}\)), dhe efekti i kripërave në përzierjet kryesore të PCR në ndërveprimet blu metilen (MB)-ADN. Rezultatet tona tregojnë se gjatësia e fragmenteve të ADN-së përcakton ndjeshëm ndjeshmërinë elektrokimike dhe demonstron në këtë punë se aftësia për të zbuluar amplikonet e gjata pa pastrimin me xhel të produkteve PCR është e rëndësishme për matjen në vend të mostrave të ujit.Një zgjidhje plotësisht e automatizuar për ngarkesën virale premton mirë.
Transmetimi i virusit nga uji është njohur si një rrezik për shëndetin publik që nga vitet 1940, me dëshmitë e para të transmetimit nga uji të poliomielitit dhe hepatitit E1. Organizata Botërore e Shëndetësisë (OBSH) ka klasifikuar disa patogjenë viralë që vijnë nga uji me rëndësi shëndetësore mesatare deri në të lartë2. Virusi tradicional metodat e zbulimit mbështeten në teknikat e bazuara në qPCR të standardit të arit, të cilat janë shumë të ndjeshme dhe specifike, por kërkojnë personel të kualifikuar për të testuar në laborator duke përdorur instrumente të shtrenjta. Megjithatë, në vendet me të ardhura të ulëta dhe mesatare (LMIC) me burime të kufizuara testimi i mostrave ka të ngjarë të ketë përparësi ndaj monitorimit mjedisor të mostrave të ujit. Prandaj, nevojiten metoda alternative me kosto të ulët për monitorimin e qëndrueshëm dhe në kohë reale të mostrave të ujit dhe ujërave të zeza në vendet me të ardhura të ulëta dhe mesatare, si paralajmërime të hershme të shpërthimeve të sëmundjeve në zhvillim. duke i mbrojtur ata nga ndikimet e rënda socio-ekonomike të pandemisë së virusit. Biosensorët elektrokimikë me kosto të ulët për acidet nukleike mund të ofrojnë një zgjidhje potenciale premtuese për këtë nevojë të paplotësuar. Shumë nga këta biosensorë të ADN-së funksionojnë nga fakti se vargjet plotësuese të ADN-së janë të palëvizshme në elektrodë sipërfaqja dhe hibridizoni kur një sekuencë përputhëse është e pranishme në kampion. Kjo më pas mund të shndërrohet në një sinjal me anë të teknikave të ndryshme elektrokimike duke përdorur ndërmjetësues redoks si hekuri/ferrocianidi i kaliumit. Blu metileni (MB) është një molekulë e tillë redoks-aktive, e cila ka është raportuar se ndërthuret në ADN me dy zinxhirë (dsDNA) përveç lidhjes së saj më jospecifike me ADN-në me një fije 5,6. Natyra ndërthurëse e MB për të formuar komplekse MB-ADN i bën ato një zgjedhje popullore si ndërmjetës redoks në disa ADN elektrokimike konfigurimet e sensorit5,6,7,8,9. Edhe pse ndërthurja e MB në ADN është jospecifike, dhe specifika e këtij sensori elektrokimik varet kryesisht nga pastërtia e primerëve të përdorur për PCR ose amplifikimin izotermik, ai është i përshtatshëm për zbatimin real -qPCR me bazë elektrokimike në kohë ose amplifikimi izotermik me fluoreshencë si një alternativë ndaj matjes së përqendrimit të ADN-së 9 .Në një zbatim të tillë, Won et al. Sipërfaqja e elektrodave të arit u modifikua me 6-merkapto-1-hexanol (MCH) për kohë reale matja e amplikoneve PCR me MB duke përdorur voltammetrinë diferenciale të pulsit (DPV)9. Në raste të tjera, Ramirez et al. Zbulimi i SARS-CoV-2 në ujërat e zeza nga reaksioni RT-LAMP duke përdorur MB me elektroda të printuara në ekran. Janë përdorur edhe elektroda platini përdoren si elektroda in situ në një platformë PCR mikrofluidike të projektuar për të zbuluar elektrokimikisht amplikonet gjatë reaksioneve 8 .Të gjitha këto studime kërkojnë modifikim të sipërfaqes së elektrodave, duke nënkuptuar rritjen e kostove të prodhimit dhe funksionimit për shkak të kërkesave të veçanta të ruajtjes për qëndrueshmërinë e këtyre elektrodave të funksionalizuara.
Skema e rrjedhës së punës për zbulimin elektrokimik të amplikoneve të marra nga grimcat e përqendruara virale në mostrat e ujit të liqenit.
Kohët e fundit kemi demonstruar ndjeshmërinë elektrokimike të amplikonëve SARS-CoV-2 me elektroda me kosto të ulët të bordit të qarkut të printuar (PCB) bazuar në DPV dhe voltammetrinë ciklike (CV) të shkaktuar nga adsorbimi i komplekseve MB-ADN në sipërfaqen e elektrodave të pamodifikuara) ndryshime në kulmin aktuale11.Ne raportojmë se fragmentet më të gjata të ADN-së (N1-N2, \({943}\, \hbox) të formuara duke përdorur primerët N1 përpara dhe N2 të rekomanduar nga CDC krahasuar me fragmentet më të shkurtra {bp}\)) treguan linearitet më të mirë në përgjigjen e sensorit ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) i formuar duke përdorur grupet e primerëve përpara dhe N1 të kundërt. Këto studime raportohen duke përdorur hollime të ADN-së të përgatitura në ujë pa nukleazë. Platforma u përdor gjithashtu për të zbuluar SARS-CoV -2 amplikone në mostrat e simuluara të ujërave të zeza (të marra nga gërmimi i mostrave totale të ARN-së me ARN SARS-CoV-2). Meqenëse ARN është e ndjeshme ndaj prerjes gjatë izolimit dhe përpunimit në rrjedhën e poshtme,12,13 është e vështirë të amplifikohen fragmente më të gjata me këtë kampion heterogjen. Prandaj, demonstrimi i ndjeshmërisë elektrokimike të amplikonit SARS-CoV-2 në ujërat e zeza është i kufizuar në fragmentin më të shkurtër \(72\,\hbox {bp}\) N1.
Në këtë punë, ne hetuam mundësinë e ndjeshmërisë elektrokimike të bazuar në PCB ENIG të fagut Phi6 të përqendruar dhe të izoluar nga mostrat e ujit të liqenit (Fig. 1). Fagët Phi6 janë të krahasueshëm në madhësi (80-100 nm) me SARS-CoV-2 dhe gjithashtu kanë një membranë lipidike dhe një proteinë me thumba. Për këto arsye, bakteriofagu Phi6 është një zëvendësues popullor për SARS-CoV-2 dhe viruse të tjera të ARN-së patogjene të mbështjella14,15. ARN-ja e izoluar nga grimcat e fagut u përdor si një shabllon për sintezën e cDNA-së e ndjekur nga PCR për të marrë dy fragmente të ADN-së me gjatësi 117 dhe 503 çifte bazash. Duke pasur parasysh sfidën e përforcimit të fragmenteve \(943\,\hbox {bp}\) N1-N2 në punën tonë të mëparshme, ne synojmë fragmente me gjatësi të ndërmjetme (\(117 \,\hbox {bp}\) dhe \(503 \,\hbox {bp}\)), bazuar në abetaret e disponueshme. Përgjigja e sensorit elektrokimik u studiua sistematikisht në një gamë të gjerë përqendrimi (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) në \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\))) Për të dy fragmentet në prania e MB, efekti i kripës në përgjigjen e sensorit është karakterizuar dhe vërtetuar ndërthurur nga matjet spektrofotometrike. Kontributet kryesore të kësaj pune janë si më poshtë:
Gjatësia e fragmentit të ADN-së dhe prania e kripës në mostër ndikojnë fuqishëm në ndjeshmëri.Rezultatet tona tregojnë se aktiviteti elektrokimik varet nga mekanizmat e ndryshëm të ndërveprimit të MB, ADN-së dhe sensorit në përgjigjen voltammetrike, në varësi të përqendrimit dhe gjatësisë së ADN-së, me fragmente më të gjata tregojnë ndjeshmëri më të lartë, megjithëse kripa ka një efekt negativ në ndërveprimet elektrostatike midis MB dhe ADN.
Përqendrimi i ADN-së përcakton mekanizmin e ndërveprimit MB-ADN në elektroda të pamodifikuara Ne demonstrojmë se mekanizmat e ndryshëm të ndërveprimit MB-ADN varen nga përqendrimi i ADN-së. {l}}}\), kemi vërejtur se përgjigja e rrymës elektrokimike përcaktohej kryesisht nga adsorbimi i MB-ADN-së në elektrodë, ndërsa në përqendrime më të ulëta Në përqendrime të larta të ADN-së, përgjigja e rrymës elektrokimike u përcaktua nga frenimi sterik i redoksit. aktiviteti për shkak të futjes së MB ndërmjet çifteve të bazave të ADN-së.
Ndjeshmëria elektrokimike e bazuar në PCB ENIG e acideve nukleike virale në mostrat e ujit të liqenit Vëzhgimet u vërtetuan me zbulimin elektrokimik të fragmenteve të ADN-së \(503\,\hbox {bp}\) të shtuara nga Phi6 të marra nga mostrat e ujit nga Liqeni Powai, Kampusi IIT Mumbai Fagu i rezultatit.
Kosto e ulët e zbatimit dhe potencial për integrim në sisteme monitorimi plotësisht të automatizuara, oligonukleotide ose aptamera në elektroda me jetëgjatësi më të gjatë.
Fagu Phi6 është një virus i mbështjellë dsRNA i familjes Cytoviridae që infekton Pseudomonas syringae. Gjenomi i fagut Phi6 ekziston në formën e 3 fragmenteve: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) dhe L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Meqenëse fagu Phi6 infekton një lloj BSL-1 Pseudomonas jo patogjen, është i sigurt për t'u përdorur dhe mund të rritet lehtësisht në laborator. Phage Phi6 dhe nikoqiri i tij Pseudomonas syringae janë blerë nga Qendra e Referencës Felix d'Herelle për Viruset Bakterike, Universiteti Laval, Kanada (numrat e katalogut të qendrës së referencës janë përkatësisht HER-102 dhe HER-1102) Fagu Phi6 dhe pritësi i tij u ringjallën sipas udhëzimeve nga qendra e referencës. Fagu Phi6 u pastrua me lizën dhe elucionin e pllakës për të marrë titrat përfundimtarë me \(\rreth 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (njësi që formojnë pllakë/mililitra). ARN u izolua nga grimcat e pastruara të fagut duke përdorur GenElute™ Universal Total ARN Purification Kit (Sigma-Aldrich) sipas udhëzimeve të prodhuesit. Shkurtimisht, një suspension i pastruar i fagut Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) u lizua dhe lizati u ngarkua në një kolonë spin për të lejuar që ARN të lidhet me kolonën e rrëshirës. Më pas ARN-ja elurohet në tretësirën e elucionit \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) të ofruara nga kompleti. Vlerësoni përqendrimin e ARN-së nga absorbimi në \(260\,\hbox {nm}\). ARN u ruajt në sasi të vogla në \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) deri në përdorim të mëtejshëm.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Kompleti i sintezës cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) u përdor si shabllon për sintezën e cDNA-së duke ndjekur udhëzimet e prodhuesit. Shkurtimisht, një reagim i sintezës cDNA përbëhet nga 3 hapa: mbushja në \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , transkriptim i kundërt i \({20}\,{\hbox {min}}\) në \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), dhe anasjelltas Regjistruesi është në \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) për \({1}\,{\hbox {min. }}\). Kur përdoret në një xhel agaroze 1%, cDNA tregoi tre breza që korrespondojnë me tre fragmentet e pritshme të ARN-së (të dhënat nuk tregohen). Primerët e mëposhtëm u përdorën për të amplifikuar dy fragmente të ADN-së me gjatësi 117 dhe 503 bp. duke përdorur cDNA si shabllon për PCR në një ciklues termik miniPCR® mini8:
Abetaret për \(117\,\hbox {bp}\) dhe \(503\,\hbox {bp}\) korrespondojnë me 1476-1575 nukleotide të segmentit M dhe 458-943 nukleotide të segmentit L, përkatësisht acid .Të gjitha produktet e amplifikuara PCR u elektroforizuan në xhel agarozë 1% dhe ADN-ja e amplifikuar e synuar u pastrua duke përdorur GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific).
Një liqen në kampusin IIT Mumbai (Powai Lake, Powai, Mumbai) u përdor për të shtuar grimcat e fagut. Uji i liqenit u filtua përmes një membrane \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) për t'u hequr grimcat e pezulluara dhe më pas u shtua fagu Phi6. Shto \({1}\,{\hbox {ml}}\) të \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) në \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) uji i filtruar i liqenit, në \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Një pjesë e vogël u e rezervuar për matjen e ngarkesës virale me anë të analizës së pllakës. Ne testuam dy metoda të ndryshme për të përqendruar grimcat e mpiksura të virusit Phi6: (1) metodën e adsorbimit-precipitimit të hidroksidit të aluminit,19 e cila është vërtetuar për përqendrimin e disa viruseve ARN të mbështjellë nga mostrat mjedisore, dhe (2) ) Metoda e përqendrimit të virusit me bazë polietilen glikol (PEG) u përshtat nga Flood et al.20 .Duke qenë se efikasiteti i rikuperimit i metodës së bazuar në PEG rezultoi të ishte më i mirë se ai i metodës së hidroksidit të aluminit, metoda e bazuar në PEG u përdor për të përqendruar grimcat Phi6 nga mostrat e ujit të liqenit.
Metoda PEG e përdorur ishte si më poshtë: PEG 8000 dhe \(\hbox {NaCl}\) u shtuan në mostrat e ujit të liqenit me thumba Phi6 për të marrë 8% PEG 8000 dhe \(0.2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Mostrat u inkubuan në një shaker\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), më pas centrifugohet në \(4700 \,\hbox {g}\) është \({45}\,{\hbox {min}}\). Hidhni supernatantin dhe risuspendoni peletin në \({1}\, {\hbox {ml}}\) në të njëjtin supernatant. Të gjitha eksperimentet e spikingut dhe përqendrimit të virusit u kryen trefish. Pas përqendrimit, një pjesë e vogël u rezervua për matjen e efikasitetit të rikuperimit me anë të analizës së pllakës. ARN u izolua siç përshkruhet më parë dhe u elua në tampon elucioni të furnizuar nga kompleti\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Meqenëse përqendrimi i ARN-së do të ndryshojë nga kampioni në kampion në tre kopje, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) e ARN-së përdoret për të treja, pavarësisht nga përqendrimi i saj, sinteza e cDNA-së e mostrave. Sinteza e cADN-së u krye siç përshkruhet më parë.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA u përdor si shabllon për \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR për 35 cikle për të amplifikuar \ (117\,\hbox {bp}\) dhe \(503\,\hbox { bp}\) fragmente. Këto mostra përfaqësohen si "1:1", pra pa hollim. Një kontroll pa shabllon (NTC) u krijua si një kontroll negativ, ndërsa një cDNA e sintetizuar duke përdorur ARN të izoluar nga fagu i pastruar u krijua. si një shabllon për një kontroll pozitiv (PC). PCR sasiore (qPCR) u krye në një instrument Stratagene Mx3000P RT-PCR duke përdorur Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Reaksionet u vendosën në tre kopje si më parë i përshkruar. Pragu i ciklit (Ct) u regjistrua për të gjitha mostrat. Përveç kësaj, mostrat e holluara ishin \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) duke përdorur cADN të holluar 1:100 në ujin e filtruar të liqenit si \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR për 35 cikle. Këto mostra përfaqësohen si "1:100".
Elektrodat PCB janë fabrikuar duke përdorur një proces të disponueshëm komercialisht me kosto të ulët Electroless Nickel Immersion Gold (ENIG) pa nevojën për veshje shtesë me ar. Specifikimet e elektrodave PCB ENIG janë të detajuara në punën tonë të mëparshme11. Për elektrodat PCB ENIG, metodat tradicionale të pastrimit të elektrodave si p.sh. Tretësira e piranhasë ose voltammetria ciklike e acidit sulfurik nuk rekomandohen pasi ato mund të shkaktojnë lëkurë të shtresës së hollë të arit (trashësia \(\përafërsisht\) \(100\,\hbox {nm }\)) dhe të ekspozojnë shtresat themelore të bakrit që janë të prirura ndaj korrozionit 21, 22, 23, 24, 25. Prandaj, pastroni elektrodat me një leckë pa garzë të lagur me IPA. Mostra që do të testohej u inkubua me \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB në \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) për futje të lehtë. Në punën tonë të mëparshme , vumë re se ndjeshmëria dhe lineariteti i sensorit u përmirësuan duke rritur përqendrimin MB 11 .Bazuar në optimizimet e raportuara në punën tonë të mëparshme, ne përdorëm \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB përqendrimet për të futur ADN-në në këtë studim. Zbulimi elektrokimik i ADN-së me dy zinxhirë (ds-DNA) mund të arrihet duke përdorur ndërkaluesit anionikë ose kationikë. Edhe pse ndërkaluesit anionikë zbulojnë ADN-në me selektivitet më të mirë, ata kërkojnë inkubacion gjatë natës, duke rezultuar në kohë më të gjata zbulimi. nga ana tjetër, ndërkaluesit kationikë të tillë si MB kërkojnë kohë më të shkurtra inkubimi, afërsisht \({1}\,{\hbox {h}}\) për zbulimin elektrokimik të ds-DNA6. Çdo matje përfshin shpërndarjen e mostrës që do të testohet në elektrodë\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), pastaj pastroni me një leckë të lagur me IPA, përpara se të vazhdoni me një mostër tjetër.një matje. Çdo kampion u testua në 5 elektroda të ndryshme, përveç rasteve kur thuhet ndryshe. Matjet e DPV dhe CV u kryen duke përdorur një potentiostat PalmSens Sensit Smart dhe softueri PSTrace u përdor për konfigurimin dhe marrjen e të dhënave të potenciostatit, duke përfshirë llogaritjet e rrymës së pikut. Janë përdorur cilësimet e mëposhtme për matjet DPV dhe CV:
DPV: Koha e ekuilibrit = \(8\,\hbox {s}\), Hapi i tensionit = \(3\,\hbox {mV}\), Tensioni i pulsit = \(25\,\hbox {mV}\) , kohëzgjatja e pulsit = \(50\,\hbox {ms}\), shpejtësia e skanimit = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Koha e ekuilibrit = \(8\,\hbox {s}\), Hapi i tensionit = \(3\,\hbox {mV}\), Shpejtësia e fshirjes = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Rrymat maksimale të marra nga voltamogramet e ADN-së të kompleksuara me \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Voltamogramet DPV dhe CV janë marrë në elektrodat PCB ENIG \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB të kompleksuara me ADN (në përqendrime prej 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) dmth 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) për \(117\,\hbox {bp}\ ) dhe 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) për \(503\,\hbox {bp}\)). Voltammogramet përfaqësuese janë paraqitur në figurën S1 në informacionin plotësues. Figura 2 tregon rezultatet i matjeve të DPV dhe CV (rryma maksimale) duke përdorur produkte PCR të pastruara me xhel. Krahasuar me matjet CV, matjet e DPV tregojnë ndjeshmëri më të lartë (rryma në funksion të përqendrimit të ADN-së) sepse rrymat kapacitore të sfondit në matjet CV fshehin rrymat Faradaike 26. Të dhënat për çdo kuti në parcelën e kutisë përmban matje nga 5 elektroda. Të gjitha matjet përdorin të njëjtin grup elektrodash për të shmangur gabimet e matjes për shkak të variacionit elektrodë në elektrodë. Ne vumë re një tendencë në rritje në rrymat e pikut të matur DPV dhe CV për përqendrime më të ulëta të ADN-së , më i gjatë (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ krahasuar me \(117) ) fragment. Kjo është në përputhje me tendencën e pritur të adsorbimit të elektrodës të raportuar në punën tonë të mëparshme. adsorbimi i kompleksit MB-ADN lehtëson transferimin e ngarkesës në elektrodë, gjë që kontribuon në rritjen e rrymës së pikut. Studime të tjera kanë treguar efektin e madhësisë dhe sekuencës së oligonukleotideve në ndërthurjen e MB-ADN27,28,29,30. Guanina -përmbajtja e citozinës (GC) e dy amplikoneve (\(117\,\hbox {bp}\) dhe \(503\,\hbox {bp}\)) ishte afërsisht 50%, që tregon se vëzhgimi Dallimi është për shkak në gjatësinë e amplikonit. Megjithatë, për përqendrime më të larta të ADN-së (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), për \(503\,\hbox {bp} \) dhe \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) për \(117\,\hbox {bp}\)), ne vëzhgojmë dy përforcime Rrymat e pikut të nënsave reduktohen si në matjet DPV ashtu edhe në CV. Kjo ndodh sepse MB ngop dhe ndërthuret ndërmjet çifteve bazë të ADN-së, duke rezultuar në frenim sterik të aktivitetit redoks të grupit të reduktueshëm në MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Kripërat e pranishme në përzierjet kryesore të PCR ndërhyjnë në ndërveprimet elektrostatike midis MB dhe ADN-së, kështu që duke shtuar \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) me \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB produkt i pastruar me xhel për të studiuar efektin e kripës në ndërveprimin MB-ADN. Siç tregohet në figurën 3, kemi vërejtur se për përqendrime më të larta të ADN-së (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) dhe \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) për \(117\,\hbox {bp} \)), në DPV dhe CV Shtimi i kripës nuk ndikoi ndjeshëm në matjet (shih Figurën S2 te Informacioni Suplementar për voltamogramet përfaqësuese). Megjithatë, në përqendrimet më të ulëta të ADN-së, shtimi i kripës ul ndjeshëm ndjeshmërinë, duke rezultuar në asnjë ndryshim të rëndësishëm në rrymën me përqendrimin e ADN-së. Efekte të ngjashme negative të kripës në ndërveprimet dhe ndërthurjen e MB-ADN-së janë raportuar më parë nga studiues të tjerë33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) kationet lidhen me shtyllën kurrizore negative të fosfatit të ADN-së, duke penguar kështu ndërveprimin elektrostatik midis MB dhe ADN-së. Në përqendrime më të larta të ADN-së, frenimi sterik i MB-ve redoks-aktive rezulton në rryma maksimale më të ulëta, kështu që ndërveprimet elektrostatike nuk ndikojnë ndjeshëm në përgjigjen e sensorit. Pika kryesore është se ky biosensor është më i përshtatshëm për të zbuluar përqendrime më të larta të ADN-së (rrallë \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) ose më e lartë), për përpunimin plotësisht të automatizuar të mostrave të ujit mjedisor, ku pastrimi me xhel i produkteve PCR mund të mos jetë i realizueshëm.
Zona nën lakoren e përthithjes për diapazonin e gjatësisë valore 600–700 \(\hbox {nm}\) për përqendrime të ndryshme të ADN-së të kompleksuar me \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) me dhe pa kripë (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) me dhe pa kripë (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {pg}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Përqendrimet e ADN-së që korrespondojnë me \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) mostrat MB Nuk ka ADN.
Për të verifikuar më tej rezultatet e mësipërme, ne kryem matje optike duke përdorur një spektrofotometër UV/Vis (Thermo Scientific Multiskan GO), mostrat \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) u përdorën për secilin Matja. Nënshkrimi i përthithjes zvogëlohet me rritjen e përqendrimit të ADN-së, siç mund të shihet nga tendenca e zonës nën kurbën e përthithjes për diapazonin e gjatësisë së valës \(600\,\hbox {nm}\) në \(700\,\hbox { nm}\) , siç tregohet në Fig. 4 (spektri i përthithjes tregohet në Fig. S3 te Informacioni Suplementar). Për mostrat me përqëndrime të ADN-së më pak se \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), nuk kishte dallim të rëndësishëm në marrjen midis mostrave që përmbajnë ADN dhe mostrave vetëm MB (për \(503\,\hbox {bp}\) dhe \(117\,\hbox {bp}\ ) fragmente të gjatësisë), që tregojnë mungesën e frenimit sterik të MB-së redoks-aktive. Në përqendrime më të larta të ADN-së, ne vërejtëm një rënie graduale të sinjalit të absorbimit dhe vumë re një rënie më të vogël të absorbimit në prani të kripës. Këto rezultate i atribuohen molekulare ndërveprimet dhe frenimi sterik me grumbullimin e bazës në hibridet e ADN-së. Rezultatet tona janë në përputhje me raportet në literaturë mbi studimet spektroskopike të ndërthurjes së MB-ADN-së që lidhin hipokromatikitetin me nivelet e reduktuara të energjisë në \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) kalimet elektronike për shkak të ndërthurjes Shtresat 36, 37, 38.
Elektroforeza me xhel agaroze e fagut Phi6: Produkte PCR me gjatësi \(117\,\hbox {bp}\) dhe \(503\,\hbox {bp}\) nga mostrat e ujit të liqenit. Markeri M-ADN;Kontrolli NTC-pa shabllon, abetare që përmbajnë amplikone përkatëse;kontroll pozitiv PC;Mostrat e ujit të liqenit me pika 1, 2, 3 të paholluara (1:1) në tre kopje. Një brez është i dukshëm në \(\rreth 50\,\hbox {bp}\) për shkak të oligonukleotideve të papërdorura në \(503\,\ hbox {bp}\) korsi.
Ne vlerësuam dobinë e sensorit duke përdorur mostrat e ujit të liqenit Powai të mbushura me fag Phi6. Përqendrimet e ARN-së të izoluara nga mostrat e ujit me majë fag varionin nga 15.8–\({19.4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), ndërsa ato të izoluara nga suspensionet e fagut të pastruar ARN u vlerësua të ishte \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) me një efikasitet rikuperimi prej afërsisht 1 %. si dhe amplikonet me interes. Vlerat e Ct të regjistruara gjatë qPCR (Tabela 1) u treguan se lidhen me përqendrimin e ARN-së të izoluar nga mostrat përkatëse të ujit me pika. Vlera Ct zbulon numrin e cikleve të kërkuara për sinjalin fluoreshent në tejkalojnë pragun ose sinjalin e sfondit. Vlerat më të larta të Ct tregojnë përqendrime më të ulëta të shabllonit dhe anasjelltas. Vlerat e Ct të mostrave NTC ishin aq të larta sa pritej. Dallimi në \(\afërsisht 3\) vlerat Ct midis kontrolli pozitiv dhe mostra e provës tregon më tej se çdo kampion testues ka afërsisht 1% shabllon në krahasim me kontrollin pozitiv. Ne kemi diskutuar më parë se amplikonët më të gjatë çojnë në ndjeshmëri më të mirë. Përforcimi i fragmenteve më të gjata të izoluara nga mostrat mjedisore heterogjene është sfidues duke pasur parasysh disavantazhet me përqendrim të ulët viral dhe degradim të ARN-së. Megjithatë, me pasurimin e virusit dhe protokollin tonë të amplifikimit PCR, ne mundëm të amplifikonim me sukses fragmentin \(503\,\hbox {bp}\) për sensorin elektrokimik.
Figura 6 tregon rezultatet e sensorit elektrokimik të amplikonit të fragmentit \(503\,\hbox {bp}\), të dyja duke përdorur cDNA të paholluar si shabllon (1:1) dhe cDNA të holluar 100-fish si shabllon (1:100 ) të kryera PCR , krahasuar me NTC dhe PC (shih Figurën S4 në Informacionin Suplementar për voltamogramet përfaqësuese). Çdo kuti në skemën e kutisë në figurën 6 përmban matje nga tre mostra në 5 elektroda. Të njëjtat elektroda janë përdorur për të matur të gjitha mostrat për të shmangur gabimet për shkak të elektrodës -variacioni ndaj elektrodës. Krahasuar me matjet CV, matjet DPV tregojnë rezolucion më të mirë për të dalluar mostrat e testit dhe PC nga NTC sepse, siç u përmend më parë, rrymat Faradaike janë të fshehura për shkak të rrymave kapacitore të sfondit në këtë të fundit. Për amplikonët më të gjatë, ne kemi vërejtur se kontrolli negativ (NTC) rezultoi në rryma më të larta të pikut CV dhe DPV në krahasim me kontrollin pozitiv, ndërsa mostrat e testit pozitiv dhe të paholluar treguan lartësi të ngjashme të pikut të rrymave të pikut DPV. Vlerat mesatare dhe mesatare të matura për çdo të paholluar (1:1 ) mostra e provës dhe PC mund të zgjidhen qartë nga dalja e sensorit për kampionin NTC, ndërsa rezolucioni për kampionin e holluar 1:100 është më pak i theksuar. Për një hollim 100-fish të cDNA, ne nuk kemi vërejtur asnjë brez gjatë elektroforezës së xhelit (korsitë nuk tregohen në figurën 5), dhe rrymat përkatëse të pikut të DPV dhe CV ishin të ngjashme me ato të pritura për NTC. Rezultatet për fragmentin \(117\,\hbox {bp}\) tregohen në Informacion shtesë. Negativi kontrolli shkaktoi një përgjigje elektrokimike nga sensori PCB për shkak të adsorbimit të MB të lirë në elektrodë dhe ndërveprimit të MB me oligonukleotidin primer me një fije floku. Prandaj, sa herë që testohet një mostër, duhet të ekzekutohet një kontroll negativ dhe rryma e pikut të kampionit të provës në krahasim me rrymën e pikut të marrë nga kontrolli negativ për të arritur një matje diferenciale (relative)39,40 për të klasifikuar kampionin e provës si pozitive ose negative.
(a) DPV dhe (b) rryma maksimale CV për zbulimin elektrokimik të fragmenteve \(503\,\hbox {bp}\) në mostrat e ujit të liqenit. Mostrat e provës u matën në tre kopje dhe u krahasuan me kontrollet pa shabllon (NTC) dhe kontrollet pozitive (PC).
Gjetjet tona ilustrojnë mekanizma të ndryshëm që ndikojnë në performancën e sensorëve elektrokimikë për amplikonët me gjatësi të ndryshme për ADN-të e ndryshme, me përqendrime të verifikuara me matje optike duke përdorur një spektrofotometër UV/Vis. Vëzhgimet tona nënvizojnë idenë se fragmentet më të gjata të ADN-së deri në \(\përafërsisht\) \(500\,\hbox {bp}\) mund të zbulohet me ndjeshmëri më të lartë dhe se prania e kripës në kampion nuk e bën ndjeshmërinë përqendrimin e ADN-së që ndikon në ndjeshmërinë më të lartë (rrallë \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) dhe më lart). Përveç kësaj, ne hetuam efektin e llojeve të ndryshme të mostrave, duke përfshirë amplikonët e pastruar me xhel me dhe pa kripë të shtuar, dhe shtimin e mostrave të ujit të liqenit në matjet DPV dhe CV.Ne vumë re se DPV ofroi rezolucion më të mirë, pasi rryma kapacitore e sfondit ndikon gjithashtu në matjen e CV, duke e bërë atë më pak të ndjeshëm.
Amplifikimi i fragmenteve më të gjata varet nga integriteti i ARN-së gjenomike virale. Disa studime kanë treguar se amplifikimi i fragmenteve më të gjata nuk është gjithmonë efikas për shkak të degradimit të ARN-së në mjedis dhe potencialit për bashkim gjatë izolimit11,41,42,43,44 Ne vumë re se metoda e përqendrimit të virusit të bazuar në PEG ishte më efektive në përqendrimin e fagut Phi-6 të mprehtë në mostrat e ujit të liqenit sesa metoda e përqendrimit të virusit me bazë hidroksid alumini. Aftësia për të zbuluar fragmente të gjata të ADN-së rezultoi të kapërcejë kërkesën për PCR multipleks për të përforcuar shumë shabllone me gjatësi më të shkurtër dhe për të zvogëluar mundësinë e ndër-specifitetit.
Mostrat biologjike janë të pakta, kështu që ekziston nevoja për të projektuar një biosensor që kërkon mostra minimale për testim. Elektrodat PCB ENIG të përdorura në këtë studim kërkojnë vetëm \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) mostrat për testim për të mbuluar zonën efektive të elektrodave. Për më tepër, e njëjta elektrodë mund të ripërdoret pas pastrimit përpara se të shpërndahet kampioni tjetër. Mostrat e përforcuara nuk kërkojnë shtimin e ndonjë kimikati tjetër përveç blu metilenit, që është një çmim i lirë dhe kimikatet e përdorura zakonisht. Meqenëse çdo elektrodë kushton rreth 0,55 dollarë (ose 40 INR) për t'u prodhuar, ky biosensor mund të jetë një alternativë me kosto efektive për teknologjitë ekzistuese të zbulimit. Tabela 2 tregon një krahasim të kësaj pune me sensorë të tjerë të raportuar në literaturë për një kohë të gjatë Fragmentet e ADN-së në mostrat heterogjene.
Duke qenë se protokollet e zbulimit elektrokimik të bazuar në MB mbështeten në specifikën e PCR, një kufizim kryesor i kësaj metode është potenciali për përforcim jospecifik në mostrat heterogjene si ujërat e zeza dhe uji i liqenit ose përdorimi i primerëve me pastërti të ulët. Për të përmirësuar ndjeshmërinë e metodat e zbulimit elektrokimik për zbulimin e ADN-së të produkteve PCR të papurifikuara duke përdorur elektroda të pamodifikuara ENIG PCB, është e nevojshme të kuptohen më mirë gabimet e paraqitura nga dNTP-të dhe primerët e papërdorur dhe të optimizohen kushtet e reagimit dhe protokollet e analizës. Parametrat fiziko-kimikë shtesë si pH, temperatura dhe biologjike Kërkesa për oksigjen (BOD) e mostrës së ujit mund të duhet gjithashtu të matet për të përmirësuar saktësinë e matjes.
Si përfundim, ne propozojmë një sensor elektrokimik ENIG PCB me kosto të ulët për zbulimin e virusit në mostrat mjedisore (uji liqeni). Ndryshe nga elektrodat oligonukleotide të imobilizuara ose substratet e personalizuara për sensorin e ADN-së që kërkojnë ruajtje kriogjenike për të ruajtur ndjeshmërinë, 53,54 teknika jonë përdor PCB të pamodifikuar elektroda me jetëgjatësi më të gjatë dhe pa kërkesa specifike për ruajtje dhe për këtë arsye të përshtatshme për zhvillimin e zgjidhjeve matëse me përpunim të automatizuar të kampionit të vendosur në LMIC. Biosensori përdor ngjyra të lira redoks që ndërthurin ADN-në (MB) për zbulimin e shpejtë të amplikoneve të synuara. Përforcimi jospecifik e zakonshme në mostrat mjedisore zvogëlon specifikën e kësaj metode ndijuese për shkak të lidhjes jospecifike të MBs me oligonukleotidet me një dhe dy fije floku. Prandaj, specifika e këtij testi varet nga optimizimi i primerëve dhe kushteve të reagimit PCR. Përveç kësaj, CV dhe rrymat e pikut të DPV të marra nga mostrat e testuara duhet të interpretohen në lidhje me përgjigjet e marra nga kontrolli negativ (NTC) për çdo provë. Dizajni dhe metodat e sensorëve elektrokimikë të paraqitur në këtë punë mund të integrohen me mostrat automatike për të zhvilluar një sistem plotësisht të automatizuar dhe të ulët. - Zgjidhje me kosto që mund të mbledhë dhe analizojë mostra dhe të transmetojë me valë rezultatet në laborator.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Metodat për përqendrimin fillestar të viruseve nga mostrat e ujit: një rishikim dhe meta-analizë e studimeve të fundit.J.Aplikimi.mikroorganizëm.115, fq 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Viruset nga uji: Barrierat për ujin e pijshëm të sigurt. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. et al. Epidemiologjia e ujërave të zeza për mbikqyrjen në shkallë të gjerë me kosto efektive të COVID-19 në vendet me të ardhura të ulëta dhe të mesme: sfidat dhe mundësitë. Uji 13, 2897 (2021).
Palecek, E. & Bartosik, M. Elektrokimia e acidit nukleik.Kimike.Rev.112, 3427–3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN Blu metileni si një diskriminues elektrokimik i oligonukleotideve me një dhe dy fije floku të imobilizuar në substrate ari. Analist 126, 1756-1759 (2001).
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Krahasimi i Ndërkaluesve të kationit dhe anionit për transduksionin elektrokimik të hibridizimit të ADN-së nga Transferimi i elektroneve me rreze të gjatë.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Transferimi i ngarkesës përmes ADN-së: një biosensor elektrokimik selektiv i ADN-së.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. Pajisja mikrofluidike PCR në kohë reale me zbulimin e njëkohshëm elektrokimik. Sensori biologjik. Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al.Studimi i mekanizmit sinjalizues dhe verifikimi i performancës së një sistemi elektrokimik PCR në kohë reale bazuar në ndërveprimin e blu metilenit me ADN-në.Analist 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Sensori elektrokimik i bazuar në amplifikim izotermik i ndërmjetësuar nga loop për zbulimin e sars-cov-2 në mostrat e ujërave të zeza.J.Environment.Chemical.Britani.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al.Ndjeshmëria elektrokimike e amplikonëve SARS-CoV-2 me elektroda PCB. Sensori është aktivizuar.B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Zbulimi efikas i ARN-së SARS-CoV-2 në fraksionin e ngurtë të ujërave të zeza.shkencë.mjedisi i përgjithshëm.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al. Metodat analitike për zbulimin e SARS-CoV-2 në ujërat e zeza: Protokolli dhe perspektivat e së ardhmes. TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Mbijetesa e bakteriofagut të mbështjellë Phi6 (një zëvendësues për SARS-CoV-2) në pikat e avulluara të pështymës të depozituara në sipërfaqe xhami.shkencë.Rep.10, 1–10 (2020).
Dey, R., Dlusskaya, E. & Ashbolt, NJ Qëndrueshmëria mjedisore e një surrogati SARS-CoV-2 (Phi6) në amebë me jetë të lirë.J.Shëndeti i ujit 20, 83 (2021).
Mindich, L. Paketimi i saktë i tre fragmenteve gjenomike të bakteriofagut të ARN-së me dy vargje \(\varphi\)6.mikroorganizëm.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Struktura sekondare e rajonit të paketimit të fagut DH RNA\(\varphi\)6. ARN 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Një protokoll i shpejtë dhe efikas për përgatitjen e stoqeve laboratorike të bakterofagëve. PeerJ 4, e2261 (2016).
Koha e postimit: Maj-27-2022