Криовијалинајчесто се користат за криогено складирање на клеточни линии и други критични биолошки материјали, во Дјуар боци исполнети со течен азот.

Успешното зачувување на клетките во течен азот вклучува неколку фази. Иако основниот принцип е бавно замрзнување, точната техника што се користи зависи од типот на клетка и употребениот криозаштитник. Постојат неколку безбедносни аспекти и најдобри практики што треба да се земат предвид при складирање на клетки на толку ниски температури.

Овој пост има за цел да даде преглед на тоа како криовијалите се складираат во течен азот.

Што се криовијали

Криовијалите се мали, капачени ампули дизајнирани за складирање на течни примероци на екстремно ниски температури. Тие осигуруваат дека клетките зачувани во криозаштитник нема да дојдат во директен контакт со течниот азот, минимизирајќи го ризикот од клеточни фрактури, а сепак да имаат корист од екстремниот ефект на ладење на течниот азот.

Ампулите обично се достапни во различни волумени и дизајни - тие можат да бидат со внатрешен или надворешен навој со рамно или заоблено дно. Достапни се и стерилни и нестерилни формати.

Кој користиЦировијализа складирање на клетки во течен азот

Низа лаборатории на NHS и приватни лаборатории, како и истражувачки институции специјализирани за банкарство на крв од папочна врвца, биологија на епителните клетки, имунологија и биологија на матични клетки, користат криовијали за криопрезервација на клетки.

Клетките зачувани на овој начин вклучуваат Б и Т-клетки, CHO клетки, хематопоетски матични и прогениторни клетки, хибридоми, цревни клетки, макрофаги, мезенхимални матични и прогениторни клетки, моноцити, миелом, NK клетки и плурипотентни матични клетки.

Преглед на тоа како да се чуваат криовијали во течен азот

Криопрезервацијата е процес што ги зачувува клетките и другите биолошки конструкции со нивно ладење на многу ниски температури. Клетките можат да се чуваат во течен азот со години без губење на нивната одржливост. Ова е преглед на процедурите што се користат.

Подготовка на клетки

Точниот метод за подготовка на примероци ќе варира во зависност од типот на клетка, но генерално, клетките се собираат и центрифугираат за да се добие пелет богат со клетки. Потоа овој пелет се ресуспендира во супернатантот измешан со криопротектор или медиум за криоконзервација.

Криопрезервативен медиум

Овој медиум се користи за зачувување на клетките во нискотемпературни средини на кои ќе бидат изложени, со инхибирање на формирањето на интрацелуларни и екстрацелуларни кристали, а со тоа и на клеточната смрт. Нивната улога е да обезбедат безбедна, заштитна средина за клетките и ткивата за време на процесите на замрзнување, складирање и одмрзнување.

Медиум како што е свежо замрзната плазма (FFP), хепаринизиран раствор на плазмалит или раствори без серум или животински компоненти се меша со криопротектори како што се диметил сулфоксид (DMSO) или глицерол.

Ревтечнетиот примерок од пелетот се аликвотира во полипропиленски криовијали како што сеСуџоу Аце Биомедицинска компанија Криогени ампули за складирање.

Важно е да не се преполнуваат криовијалите бидејќи тоа ќе го зголеми ризикот од пукање и можното ослободување на содржината (1).

Контролирана стапка на замрзнување

Општо земено, за успешна криопрезервација на клетките се користи бавна контролирана брзина на замрзнување.

Откако примероците ќе се аликвотираат во криогени ампули, тие се ставаат на влажен мраз или во фрижидер на 4℃, а постапката за замрзнување започнува во рок од 5 минути. Како општ водич, клетките се ладат со брзина од -1 до -3 во минута (2). Ова се постигнува со помош на програмабилен ладилник или со ставање на ампули во изолирана кутија сместена во замрзнувач со контролирана брзина од -70°C до -90°C.

Трансфер во течен азот

Замрзнатите криогени ампули потоа се префрлаат во резервоар со течен азот на неопределено време, под услов да се одржува температура помала од -135℃.

Овие ултраниски температури може да се добијат со потопување во азот во течна или парна фаза.

Течна или парна фаза?

Познато е дека складирањето во течна фаза на азот ја одржува ниската температура со апсолутна конзистентност, но често не се препорачува од следниве причини:

• Потребата од големи количини (длабочина) на течен азот што претставува потенцијална опасност. Изгореници или задушување поради ова се реален ризик.
• Документирани случаи на вкрстена контаминација со инфективни агенси како што се аспергилус, хепатитис Б и ширење на вирусот преку течен азотен медиум (2,3)
• Можност за истекување на течен азот во шишенцата за време на потопување. Кога ќе се извади од складирање и ќе се загрее на собна температура, азотот брзо се шири. Следствено, шишенцата може да се скрши кога ќе се извади од складирање на течен азот, создавајќи опасност и од летечки остатоци и од изложеност на содржината (1, 4).

Поради овие причини, складирањето на ултраниски температури најчесто е во азот во парна фаза. Кога примероците мора да се чуваат во течна фаза, треба да се користат специјализирани криофлекс цевки.

Недостатокот на парната фаза е што може да се појави вертикален температурен градиент, што резултира со температурни флуктуации помеѓу -135℃ и -190℃. Ова бара внимателно и внимателно следење на нивоата на течен азот и температурните варијации (5).

Многу производители препорачуваат криовијалите да се погодни за складирање до -135℃ или за употреба само во парна фаза.

Одмрзнување на вашите криоконзервирани клетки

Постапката на одмрзнување е стресна за замрзната култура и потребни се соодветно ракување и техника за да се обезбеди оптимална одржливост, закрепнување и функционалност на клетките. Точните протоколи за одмрзнување ќе зависат од специфичните типови клетки. Сепак, брзото одмрзнување се смета за стандардно за:

• Намалете го какво било влијание врз клеточното закрепнување
• Помага да се намали времето на изложеност на растворените супстанции присутни во медиумот за замрзнување
• Минимизирајте ја секоја штета со рекристализација на мразот

Водните бањи, бањите со монистра или специјализираните автоматизирани инструменти најчесто се користат за одмрзнување на примероците.

Најчесто, по 1 клеточна линија се одмрзнува 1-2 минути, со нежно вртење во водена бања од 37℃, сè додека не остане само мало количество мраз во шишенцето, пред да се измијат во претходно загреан медиум за раст.

За некои клетки, како што се ембрионите на цицачите, бавното затоплување е од суштинско значење за нивниот опстанок.

Клетките сега се подготвени за клеточна култура, изолација на клетки или, во случај на хематопоетски матични клетки, студии за одржливост за да се гарантира интегритетот на матичните клетки на донорот пред миелоаблативната терапија.

Вообичаена практика е да се земат мали аликвоти од претходно измиениот примерок што се користи за броење на клетките за да се утврдат концентрациите на клетките за поставување во култура. Потоа можете да ги процените резултатите од процедурите за изолација на клетките и да ја одредите одржливоста на клетките.

Најдобри практики за складирање на криовијални садови

Успешната криопрезервација на примероци складирани во криовијали зависи од многу елементи во протоколот, вклучувајќи го правилното складирање и водењето евиденција.

• Разделете ги ќелиите помеѓу локациите за складирање– Доколку волумените дозволуваат, поделете ги ќелиите помеѓу шишенцата и складирајте ги на одделни локации за да го намалите ризикот од губење на примероци поради дефекти на опремата.
• Спречете вкрстена контаминација– Пред последователна употреба, одлучете се за стерилни криогени ампули или автоклав за еднократна употреба.
• Користете ампули со соодветна големина за вашите клетки– шишенцата се достапни во различни волумени помеѓу 1 и 5 мл. Избегнувајте преполнување на шишенцата за да го намалите ризикот од пукање.
• Изберете криогени ампули со внатрешен или надворешен навој– Некои универзитети препорачуваат ампули со внатрешен навој од безбедносни мерки – тие исто така можат да спречат контаминација за време на полнењето или кога се складираат во течен азот.
• Спречување на протекување- Користете двојно инјектирани заптивки обликувани во капачето со завртка или О-прстените за да спречите протекување и контаминација.
• Користете 2D баркодови и етикетирајте ампули– за да се обезбеди следливост, шишенцата со големи површини за пишување овозможуваат секое шишенце да биде соодветно етикетирано. 2D баркодовите можат да помогнат во управувањето со складирањето и водењето евиденција. Капачињата кодирани во боја се корисни за полесна идентификација.
• Соодветно одржување на складирањето- За да се осигури дека клетките нема да се изгубат, садовите за складирање треба постојано да ја следат температурата и нивоата на течен азот. Треба да се постават аларми за да ги предупредат корисниците за грешки.

Безбедносни мерки на претпазливост

Течниот азот стана вообичаена практика во современите истражувања, но носи ризик од сериозни повреди доколку се користи неправилно.

Треба да се носи соодветна лична заштитна опрема (ЛЗО) за да се минимизира ризикот од смрзнатини, изгореници и други несакани инциденти при ракување со течен азот.

• Криогени ракавици
• Лабораториски мантил
• Целосен штитник за лице отпорен на удари кој го покрива и вратот
• Чевли со затворени прсти
• Пластична престилка отпорна на прскање

Фрижидерите со течен азот треба да се поставуваат во добро проветрени простори за да се минимизира ризикот од задушување - испуштениот азот испарува и го истиснува атмосферскиот кислород. Продавниците со голем волумен треба да имаат системи за алармирање со низок кислород.

Работата во парови при ракување со течен азот е идеална, а неговата употреба надвор од нормалното работно време треба да се забрани.

Криовијали за поддршка на вашиот работен тек

Компанијата „Суџоу Ејс Биомедикал“ нуди широк избор на производи што ги задоволуваат вашите потреби за криопрезервација за различни типови клетки. Портфолиото вклучува низа епрувети, како и низа стерилни криовијали.

Нашите криовијали се:

• Лабораториски капаче за завртување 0,5 мл 1,5 мл 2,0 мл криовијални криогени ампули со конусно дно криотуба со заптивка

  ● Спецификација од 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, со здолниште или без здолниште
  ● Достапни се конусен или самостоечки дизајн, стерилен или нестерилен
  ● Цевките со капаче за навртување се направени од полипропилен со медицински квалитет
  ● ПП криотубните ампули може постојано да се замрзнуваат и одмрзнуваат
  ● Дизајнот на надворешната капа може да ја намали веројатноста за контаминација за време на третманот на примерокот.
  ● Криогени цевки со капаче за завртка Универзални навои за завртка за употреба
  ● Цевките одговараат на најчестите ротори
  ● Криогените цевки со О-прстен одговараат на стандардни кутии за замрзнување од 1 инч и 2 инчи, 48 бунари, 81 бунар, 96 бунари и 100 бунари
  ● Може да се автоклавира до 121°C и може да се замрзнува до -86°C

  ДЕЛ БРОЈ	МАТЕРИЈАЛ	ЈАЧИНА	ЗЗПБОЈА	PCS/ТОРБА	ТОРБИ/КУТИЈА
  ACT05-BL-N	PP	0,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT15-BL-N	PP	1,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT15-BL-NW	PP	1,5 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10
  ACT20-BL-N	PP	2,0 мл	Црна, Жолта, Сина, Црвена, Виолетова, Бела	500	10