Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да се осигурате континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Важноста на следењето на примероците од животната средина е многу ценета од почетокот на пандемијата COVID-19, а некои напори за мониторинг се вршат со користење на златниот стандард, иако техниките базирани на qPCR се скапи. Електрохемиските биосензори на ДНК можат да обезбедат потенцијално рентабилна решение за следење на примероците на вода во животната средина во земјите со низок и среден приход. Во оваа работа, ние ја демонстрираме електрохемиската детекција на ампликоните добиени од Phi6 фагот изолиран од примероците на езерска вода со шилести (популарен сурогат за SARS-CoV-2), користејќи ENIG за комплетирање на ПХБ електроди без модификација на површината.пол. Електрохемискиот одговор на сензорот беше темелно карактеризиран за два фрагменти на ДНК со различни должини (\({117}\,\hbox {bp}\) и \({503}\,\hbox {bp}\)), а ефектот на солите во мастер мешавините на PCR врз интеракциите на метиленско сино (MB)-ДНК. Нашите резултати покажуваат дека должината на фрагментите на ДНК значително ја одредува електрохемиската чувствителност и демонстрира во оваа работа дека способноста да се детектираат долги ампликони без гел прочистување на PCR производите е важно за in situ мерење на примероците на вода.Целосно автоматизирано решение за вирусно оптоварување ветува добро.
Преносот на вирусот преку вода е познат како опасност по јавното здравје уште од 1940-тите, со првите докази за пренос на детска парализа и хепатитис Е1 преку вода. Светската здравствена организација (СЗО) класифицираше неколку водени вирусни патогени со умерено до високо здравствено значење2. Традиционален вирус методите за откривање се потпираат на техники засновани на qPCR со златен стандард, кои се многу чувствителни и специфични, но бараат квалификуван персонал за тестирање во лабораторија користејќи скапи инструменти. Меѓутоа, во земјите со низок и среден приход (LMICs) со ограничени ресурси, човечки Тестирањето на примероците веројатно ќе има предност пред мониторингот на примероците за вода во животната средина. Затоа, потребни се алтернативни методи со ниска цена за одржливо, во реално време следење на примероците на вода и отпадни води во земјите со низок и среден приход како рани предупредувања за појава на болести кои се појавуваат. со што ќе се заштитат од тешките социо-економски влијанија на пандемијата на вирусот. Електрохемиските биосензори за нуклеински киселини со ниска цена би можеле да обезбедат ветувачко потенцијално решение за оваа незадоволена потреба. површината и се хибридизираат кога во примерокот е присутна соодветна секвенца. Ова потоа може да се претвори во сигнал со различни електрохемиски техники користејќи редокс медијатори како калиум железо/фероцианид. Метиленско сино (MB) е една таква редокс-активна молекула, која има пријавено е дека се интеркалираат во двоверижна ДНК (dsDNA) покрај нејзиното понеспецифично врзување за едноверижна ДНК5,6. Интеркалната природа на МБ за да формираат МБ-ДНК комплекси ги прави популарен избор како редокс медијатори во неколку електрохемиски ДНК сензорски конфигурации 5,6,7,8,9.Иако интеркалирањето на MB во ДНК е неспецифично, а специфичноста на овој електрохемиски сензор во голема мера зависи од чистотата на прајмерите што се користат за PCR или изотермално засилување, тој е добро прилагоден за спроведување на реални -време qPCR базирано на електрохемиски или флуоресцентно изотермално засилување како алтернатива на мерењето на концентрацијата на ДНК 9. Во една таква имплементација, Won et al. Површината на златните електроди беше модифицирана со 6-меркапто-1-хексанол (MCH) во реално време мерење на PCR ампликони со MB користејќи диференцијална импулсна волтаметрија (DPV)9. Во други случаи, Рамирез и сор. Откривање на SARS-CoV-2 во отпадна вода со реакција RT-LAMP користејќи MB со електроди испечатени на екран. Платинските електроди исто така се се користат како електроди на самото место во микрофлуидна PCR платформа дизајнирана за електрохемиски детектирање на ампликони за време на реакциите 8 .Сите овие студии бараат површинска модификација на електродите, што подразбира зголемени трошоци за производство и работа поради посебните барања за складирање за стабилноста на овие функционализирани електроди.
Шема на работниот тек за електрохемиска детекција на ампликони добиени од концентрирани вирусни честички во примероци од езерска вода.
Неодамна демонстриравме електрохемиско сензорирање на САРС-КоВ-2 ампликоните со евтини електроди на печатено коло (PCB) базирани на DPV и циклична волтаметрија (CV) предизвикани од адсорпција на комплекси МБ-ДНК на површината на немодифицираните електроди ) максимални промени струја11.Известуваме дека подолгите фрагменти на ДНК (N1-N2, \({943}\, \hbox) формирани со користење на N1 напредни и N2 обратни прајмери препорачани од CDC во споредба со пократките фрагменти {bp}\)) покажаа подобра линеарност во одговорот на сензорот ( N1, \(72\,\hbox {bp}\)) формирана со помош на комплети N1 напред и N1 обратни прајмери. Овие студии се пријавени со користење на разредување на ДНК подготвени во вода без нуклеаза. Платформата беше користена и за откривање на САРС-КоВ -2 ампликони во симулирани примероци на отпадна вода (добиени со пробивање на вкупните примероци на РНК со РНК SARS-CoV-2). Бидејќи РНК е подложна на стрижење за време на изолацијата и обработката низводно,12,13 е тешко да се засилат подолгите фрагменти со овој хетероген примерок. Затоа, демонстрацијата на електрохемиско сензорирање на ампликонот SARS-CoV-2 во отпадната вода е ограничена на пократкиот фрагмент N1 \(72\,\hbox {bp}\).
Во оваа работа, ја истражувавме изводливоста на електрохемиското сензорирање базирано на ENIG PCB на фагот Phi6 концентриран и изолиран од примероци од езерска вода (сл. 1). Фагите Phi6 се споредливи по големина (80-100 nm) со SARS-CoV-2 и исто така, има липидна мембрана и протеин на шило. Поради овие причини, бактериофагот Phi6 е популарен сурогат за САРС-КоВ-2 и други обвиени патогени РНК вируси14,15. РНК изолирана од честички на фагот беше искористена како образец за синтеза на cDNA, проследено со PCR за да се добијат два фрагменти на ДНК со должина од 117 и 503 базни парови. Со оглед на предизвикот за засилување на \(943\,\hbox {bp}\) фрагменти N1-N2 во нашата претходна работа, ние таргетираме фрагменти со средна должина (\(117 \,\hbox {bp}\) и \(503 \,\hbox {bp}\)), врз основа на достапните прајмери. Електрохемискиот одговор на сензорот беше систематски проучуван во широк опсег на концентрации (\({10}\,{ \hbox {pg}/{\upmu \hbox {l}}}\) до \({20}\, {\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\)) За двата фрагменти во присуството на MB, ефектот на солта врз одговорот на сензорот е карактеризиран и вкрстено потврден со спектрофотометриски мерења. Главните придонеси на оваа работа се како што следува:
Должината на фрагментот на ДНК и присуството на сол во примерокот силно влијаат на чувствителноста.Нашите резултати покажуваат дека електрохемиската активност зависи од различни механизми на интеракцијата на МБ, ДНК и сензорот во волтаметрискиот одговор, во зависност од концентрацијата и должината на ДНК, со подолги Фрагментите покажуваат поголема чувствителност, иако солта има негативен ефект врз електростатските интеракции помеѓу МБ и ДНК.
Концентрацијата на ДНК го одредува механизмот на интеракцијата на МБ-ДНК во немодифицираните електроди Докажуваме дека различните механизми на интеракцијата на МБ-ДНК зависат од концентрацијата на ДНК. При концентрации на ДНК под мала количина \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), забележавме дека електрохемискиот одговор на струјата главно се определува со адсорпција на МБ-ДНК на електродата, додека при пониски концентрации При високи концентрации на ДНК, електрохемискиот одговор на струјата се одредува со стерична инхибиција на редокс активност поради вметнување на МБ помеѓу базни парови на ДНК.
Електрохемиско сензорирање на вирусни нуклеински киселини во езерската вода засновано на ENIG ПХБ Набљудувањата беа потврдени со електрохемиска детекција на фрагменти од ДНК додадени од Phi6 \(503\,\hbox {bp}\) добиени од примероци вода од езерото Поваи, кампусот IIT Мумбаи Резултат на фаг.
Ниски трошоци за имплементација и потенцијал за интеграција во целосно автоматизирани системи за следење, олигонуклеотиди или аптамери на електроди со подолг рок на траење.
Фагот Phi6 е обвиен dsRNA вирус од семејството Cytoviridae кој ги инфицира Pseudomonas syringae. Геномот на Phi6 фагот постои во форма на 3 фрагменти: S (\(2.95\,\hbox {Kb}\)), M (\(4.07 \,\hbox {Kb}\)) и L (\ (6.37\ ,\hbox{Kb}\)) 16,17. Бидејќи фагот Phi6 инфицира непатоген сој BSL-1 Pseudomonas, тој е безбеден за употреба и може лесно да се одгледува во лабораторија. Phage Phi6 и неговиот домаќин Pseudomonas syringae се купени од Референтниот центар за бактериски вируси Felix d'Herelle, Универзитетот Лавал, Канада (броевите на каталогот на референтниот центар се HER-102 и HER-1102, соодветно) .Phi6 фагот и неговиот домаќин беа оживеани како што е наведено од референтниот центар. Фагот Phi6 беше прочистен со лиза на плоча и елуција за да се добијат конечни титри со \(\околу 10^{12}\,{\hbox {PFU}/\hbox { ml}}\) (единици што формираат плакета/ милилитри). РНК беше изолирана од прочистени честички на фагот користејќи го GenElute™ Universal Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich) според упатствата на производителот. Накратко, прочистена суспензија на фаг Phi6\({ 100}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) беше лизирана и лизатот беше натоварен на спин колона за да дозволи РНК да се врзе за колоната на смолата. Потоа РНК се елуира во растворот за елуција \({ 50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) обезбедени од комплетот. Проценете ја концентрацијата на РНК со апсорпција на \(260\,\hbox {nm}\). РНК беше складирана во делови во \ ({-80}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) до понатамошна употреба.\({2}\,{\upmu \hbox {g}}\) Комплет за синтеза на cDNA iScript (Bio -Rad Laboratories) се користеше како шаблон за синтеза на cDNA следејќи ги упатствата на производителот. Накратко, реакцијата на синтеза на cDNA се состои од 3 чекори: грундирање на \({25}\,{^{\circ }\hbox {C}}\ )\({5}\,{\hbox {min} }\) , обратна транскрипција на \({20}\,{\hbox {min}}\) на \({46}\,{^{\circ }\hbox {C}}\), и обратно Снимачот е во \({95}\,{^{\circ }\hbox {C}}\) за \({1}\,{\hbox {мин. }}\). Кога се работи на 1% гел агароза, cDNA покажа три ленти што одговараат на очекуваните три фрагменти на РНК (податоци не се прикажани). користејќи cDNA како шаблон за PCR во miniPCR® mini8 термички циклер:
Прајмерите за \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) одговараат на 1476-1575 нуклеотиди од сегментот М и 458-943 нуклеотиди од сегментот L, соодветно киселина .Сите амплифицирани PCR производи беа електрофоризирани на 1% гелови од агароза, а засилената целна ДНК беше прочистена со користење на GeneJET Гел Екстракција Кит (Thermo Fisher Scientific).
Езерото во кампусот на IIT Мумбаи (Езерото Поваи, Поваи, Мумбаи) беше искористено за да се додадат честички од фаг. Водата од езерото се филтрира низ мембраната \({5}\,{\upmu \hbox {m}}\) за да се отстрани суспендирани честички, а потоа е додаден Phi6 фаг. Додадете \({1}\,{\hbox {ml}}\) од \(10^{6}\,{\hbox {PFU}/\hbox {ml}} \) до \( {100}\ ,{\hbox {ml}}\) филтрирана езерска вода, во \({4}\,{^{\circle}\hbox {C}}\). Беше мал дел резервирана за мерење на вирусното оптоварување со анализа на плакета. Тестиравме два различни методи за концентрирање на шилести честички на вирусот Phi6: (1) методот на адсорпција-таложење на алуминиум хидроксид,19 кој е потврден за концентрацијата на неколку обвиени РНК вируси од примероци од животната средина, и (2) ) Методот на концентрација на вирусот базиран на полиетилен гликол (PEG) беше адаптиран од Flood et al.20 .Бидејќи се покажа дека ефикасноста на обновувањето на методот базиран на PEG е подобра од онаа на методот на алуминиум хидроксид, методот базиран на PEG беше користен за концентрирање на честичките Phi6 од примероците на езерската вода.
Користениот метод PEG беше како што следува: PEG 8000 и \(\hbox {NaCl}\) беа додадени на примероците од езерската вода со Phi6 за да се добијат 8% PEG 8000 и \(0,2\,\hbox {M} \) \( \ hbox {NaCl}\). Примероците се инкубираат на шејкер\({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({4}\,{\hbox {h}}\ ), потоа се центрифугира на \(4700 \,\hbox {g}\) е \({45}\,{\hbox {min}}\). {\hbox {ml}}\) во истиот супернатант. Сите експерименти со шилење и концентрација на вирусот беа изведени во три примероци. По концентрацијата, мал дел беше резервиран за мерење на ефикасноста на обновување со анализа на плак. во тампон за елуција испорачан со комплет\({40}\,{\upmu \hbox {l}}\). Бидејќи концентрацијата на РНК ќе варира од примерок до примерок во три примероци, \({2}\,{\upmu \ hbox {l}}\) на РНК се користи за сите три без оглед на неговата концентрација. cDNA синтезата на примероците. Синтезата на cDNA беше извршена како што беше претходно опишано.\({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) cDNA се користеше како шаблон за \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR за 35 циклуси за засилување на \ (117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox { bp}\) фрагменти. Овие примероци се претставени како „1:1“, т.е. без разредување. Контролата без шаблон (NTC) беше поставена како негативна контрола, додека cDNA синтетизирана со помош на РНК изолирана од прочистен фаг беше поставена како шаблон за позитивна контрола (PC). Квантитативна PCR (qPCR) беше изведена во инструмент Stratagene Mx3000P RT-PCR користејќи Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies). Реакциите беа поставени во три примероци како и претходно опишан. Прагот на циклусот (Ct) беше снимен за сите примероци. Покрај тоа, разредените примероци беа \({1}\,{\upmu \hbox {l}}\) користејќи cDNA разредена 1:100 во филтрирана езерска вода како \({20}\,{\upmu \hbox {l}}\) PCR за 35 циклуси. Овие примероци се претставени како „1:100″.
Електродите на ПХБ се изработуваат со користење на комерцијално достапен процес со ниско-целосно потопување злато (ENIG) без потреба од дополнително позлатено. Растворот од пирана или цикличната волтаметрија на сулфурна киселина не се препорачуваат бидејќи може да предизвикаат лупење на тенок златен слој (дебелина \(\приближно\) \(100\,\hbox {nm }\)) и да ги изложат основните бакарни слоеви кои се склони до корозија 21, 22, 23, 24, 25. Затоа, исчистете ги електродите со крпа без влакненца натопена со IPA. Примерокот што требаше да се тестира беше инкубиран со \({50}\,{\upmu \hbox {M} }\) MB во \({4}\,{^{\circ }\hbox {C}}\)\({ 1}\,{\hbox {h}}\) за лесно вметнување. Во нашата претходна работа , забележавме дека чувствителноста и линеарноста на сензорот се подобрени со зголемување на концентрацијата на MB 11 .Врз основа на оптимизациите пријавени во нашата претходна работа, користевме \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB концентрации за да се вгради ДНК во оваа студија. Електрохемиското откривање на двоверижна ДНК (ds-DNA) може да се постигне со користење на анјонски или катјонски интеркалатори. од друга страна, катјонските интеркалатори како MB бараат пократки времиња на инкубација, приближно \({1}\,{\hbox {h}}\) за електрохемиска детекција на ds-DNA6. Секое мерење вклучува издавање на примерокот што треба да се тестира на електрода\({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\), потоа исчистете со крпа навлажнета со ИПА, пред да продолжите со друг примерок.едно мерење. Секој примерок беше тестиран на 5 различни електроди, освен ако не е поинаку наведено. Мерењата на DPV и CV беа извршени со помош на потенциостатот PalmSens Sensit Smart, а софтверот PSTrace беше користен за конфигурација на потенциостатот и стекнување податоци, вклучувајќи пресметки за врвната струја. Се користат следните поставки за мерења на DPV и CV:
DPV: Време на рамнотежа = \(8\,\hbox {s}\), чекор на напон = \(3\,\hbox {mV}\), пулсен напон = \(25\,\hbox {mV}\) , времетраење на пулсот = \(50\,\hbox {ms}\), брзина на скенирање = \({20}\,\hbox {mV/s}\)
CV: Време на рамнотежа = \(8\,\hbox {s}\), чекор на напон = \(3\,\hbox {mV}\), брзина на чистење = \({300}\,\hbox {mV/ s }\)
Врвни струи добиени од волтамограми на ДНК сложени со \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: (a) \(503\,\hbox {bp}\) DPV , (b) \ (503\,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV, (d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
DPV и CV волтамограми се добиени на ENIG PCB електроди \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB комплексни со ДНК (во концентрации од 10–\({20}\,{\ hbox {ng }/{\upmu \hbox {l}}}\) односно 0,13–\({0,26}\,{\upmu \hbox {M}}\) за \(117\,\hbox {bp}\ ) и 0,03 –\({0.06}\,{\upmu \hbox {M}}\) за \(503\,\hbox {bp}\)). Репрезентативните волтамограми се прикажани на слика S1 во дополнителни информации. на мерењата на DPV и CV (пик струја) користејќи PCR производи прочистени со гел. Во споредба со мерењата на CV, мерењата на DPV покажуваат поголема чувствителност (струја како функција на концентрацијата на ДНК) бидејќи капацитивните струи во позадина при мерењата на CV ги кријат фарадајските струи 26 .Податоците за секоја кутија во кутијата содржи мерења од 5 електроди. Сите мерења користат ист сет на електроди за да се избегнат грешки во мерењето поради варијација од електрода до електрода. Забележавме тренд на зголемување на врвните струи измерени DPV и CV за пониски концентрации на ДНК , подолг (\(503\,\hbox {bp}\)) \,\hbox {bp}\ во споредба со \(117) ) фрагмент. адсорпцијата на комплексот МБ-ДНК го олеснува преносот на полнеж на електродата, што придонесува за зголемување на врвната струја. Други студии го покажаа ефектот на големината и секвенцата на олигонуклеотид врз интеркалацијата на МБ-ДНК27,28,29,30. Гванин -содржината на цитозин (GC) на двата ампликони (\(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\)) беше приближно 50%, што покажува дека набљудувањето Разликата се должи до должина на ампликонот. Меѓутоа, за повисоки концентрации на ДНК (\(>{2}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), за \(503\,\hbox {bp} \) и \( >{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) за \(117\,\hbox {bp}\)), набљудуваме две засилувања врвните струи на подлогите се намалуваат и при DPV и CV мерења. Ова е затоа што MB се заситува и интеркалира помеѓу базните парови на ДНК, што резултира со стерична инхибиција на редокс активноста на редуцибилната група во MB31,32.
在存在 \(2\,\hbox {mM}\) \({\hbox {MgCl }_2}\): (а) \(503\,\hbox {bp}\) DPV, (b) \(503 \,\hbox {bp}\) CV, (c) \(117\,\hbox {bp}\) DPV，(d) \(117\,\hbox {bp}\) CV.
Солите присутни во мастер мешавините на PCR се мешаат во електростатските интеракции помеѓу MB и ДНК, така што со додавање на \(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl }_2\) со \({50} \,{\ upmu \hbox {M}}\) MB производ прочистен со гел за проучување на ефектот на солта врз интеракцијата на МБ-ДНК. Како што е прикажано на слика 3, забележавме дека за повисоки концентрации на ДНК (\(>{2}\,{\ hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) (503\,\hbox {bp }\) и \(>{10}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox { l}}}\) за \(117\,\hbox {bp} \)), во DPV и CV Додавањето сол не влијаеше значително на мерењата (види Слика S2 во Дополнителни информации за репрезентативни волтамограми). Сепак, на пониски концентрации на ДНК, додавањето сол во голема мера ја намалува чувствителноста, што резултира со значајна промена во струјата со концентрацијата на ДНК. Слични негативни ефекти на солта врз интеракциите и интеркалирањето на МБ-ДНК биле претходно пријавени од други истражувачи33,34.\(\hbox { Mg}^{2+}\) катјоните се врзуваат за негативниот фосфатен 'рбет на ДНК, со што ја попречуваат електростатската интеракција помеѓу МБ и ДНК. При повисоки концентрации на ДНК, стеричната инхибиција на редокс активните МБ резултира со помали врвни струи, така што електростатските интеракции не влијаат значително на одговорот на сензорот. Клучната точка е дека овој биосензор е подобро прилагоден за откривање повисоки концентрации на ДНК (ретко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) или повисоко), за целосно автоматизирана обработка на примероци од еколошка вода, каде што гел прочистување на PCR производи може да не е изводливо.
Површина под кривата на апсорпција за опсегот на бранова должина 600–700 \(\hbox {nm}\) за различни концентрации на ДНК комплексна со \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB: ( a ) \(503\,\hbox {bp}\) со и без сол (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)), (b) \( 117\, \hbox {bp}\) со и без сол (\(2\,\hbox {mM}\) \(\hbox {MgCl}_2\)).\({0}\,{\hbox {mM}/ {\upmu \hbox {l}}}\) Концентрации на ДНК што одговараат на \({50}\,{\upmu \hbox {M}}\) MB примероци Нема ДНК.
За дополнително да ги потврдиме горенаведените резултати, извршивме оптички мерења користејќи UV/Vis спектрофотометар (Thermo Scientific Multiskan GO), примероците \({50}\,{{\upmu \hbox {l}}}\) беа користени за секој Мерење. Потписот на апсорпција се намалува со зголемување на концентрацијата на ДНК, како што може да се види од трендот на областа под кривата на апсорпција за опсегот на бранова должина \(600\,\hbox {nm}\) до \(700\,\hbox { nm}\) , како што е прикажано на сл. 4 (спектар на апсорпција прикажан на сл. S3 во дополнителни информации). За примероци со концентрации на ДНК помали од \({1}\,{\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\), немаше значителна разлика во навлегувањето помеѓу примероците што содржат ДНК и примероците само MB (за \(503\,\hbox {bp}\) и \(117\,\hbox {bp}\ ) фрагменти со должина), што укажува на отсуство на стерична инхибиција на редокс-активни МБ. При повисоки концентрации на ДНК, забележавме постепено намалување на сигналот за апсорпција и забележавме помало намалување на апсорпцијата во присуство на сол. Овие резултати се припишуваат на молекуларната интеракции и стерична инхибиција со базно натрупување во ДНК хибриди. Нашите резултати се конзистентни со извештаите во литературата за спектроскопски студии за интеркалација на МБ-ДНК кои ја поврзуваат хипохроматичноста со намалените нивоа на енергија во \(\pi\)–\(\pi ^*\ ) електронски транзиции поради интеркалација Слоеви 36, 37, 38.
Електрофореза на агарозен гел на фагот Phi6: PCR производи со должина \(117\,\hbox {bp}\) и \(503\,\hbox {bp}\) од примероци од езерска вода. М-ДНК маркер;Контрола на NTC без шаблон, прајмери кои содржат соодветни ампликони;Позитивна контрола на компјутер;1, 2, 3-неразредени (1:1) примероци на езерска вода во три примероци. Појасот е видлив на \(\околу 50\,\hbox {bp}\) поради неискористените олигонуклеотиди во \(503\,\ hbox {bp}\) лента.
Ја проценивме корисноста на сензорот користејќи примероци од вода од езерото Поваи, наполнети со фаг Phi6. Концентрациите на РНК изолирани од примероци од вода со шилести фази се движеа од 15,8-\({19,4}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox { ml}}\), додека оние изолирани од прочистени суспензии на фаг. РНК се проценува дека е \({1945}\,{\upmu \hbox {g}/\hbox {ml}}\) со ефикасност на обновување од приближно 1 %. како и ампликоните од интерес. Вредностите на Ct снимени за време на qPCR (Табела 1) се покажаа дека корелираат со концентрацијата на РНК изолирана од соодветните шилести примероци на вода. Вредноста Ct го открива бројот на циклуси потребни за флуоресцентниот сигнал до го надминуваат прагот или сигналот во позадина. Повисоките Ct вредности укажуваат на пониски концентрации на шаблонот и обратно. Вредностите на Ct на примероците NTC беа високи колку што се очекуваше. Разликата во \(\приближно 3\) Ct вредностите помеѓу позитивната контрола и примерокот за тестирање дополнително укажуваат дека секој тест примерок има приближно 1% шаблон во споредба со позитивната контрола. Претходно разговаравме дека подолгите ампликони доведуваат до подобра чувствителност. Засилувањето на подолгите фрагменти изолирани од хетерогени примероци од животната средина е предизвик со оглед на недостатоците со ниска концентрација на вируси и деградација на РНК. Сепак, со нашиот протокол за збогатување на вирусот и PCR засилување, успеавме успешно да го засилиме фрагментот \(503\,\hbox {bp}\) за електрохемиско сензорирање.
Слика 6 ги прикажува резултатите од електрохемискиот сензор на фрагментот ампликон \(503\,\hbox {bp}\), и двете користат неразредена cDNA како шаблон (1:1) и 100-кратно разредена cDNA како шаблон (1:100 ) извршена PCR , во споредба со NTC и PC (види Слика S4 во Дополнителни информации за репрезентативни волтамограми). Секоја кутија во кутијата на Слика 6 содржи мерења од три примероци на 5 електроди. Истите електроди беа користени за мерење на сите примероци за да се избегнат грешки поради електродата - варијација на електрода. Во споредба со мерењата CV, мерењата на DPV покажуваат подобра резолуција за да се разликуваат примероците од тестот и компјутерот од NTC, бидејќи, како што претходно беше споменато, фарадајските струи се скриени поради капацитивните струи во позадина во вторите. За подолгите засилувачи, забележавме дека негативната контрола (NTC) резултираше со повисоки струи на CV и DPV во однос на позитивната контрола, додека позитивните и неразредените тест примероци покажаа слични врвни висини на врвните струи на DPV. Измерените средни и средни вредности за секој неразреден (1:1 ) тест примерокот и компјутерот може јасно да се отстранат од излезот на сензорот за примерокот NTC, додека резолуцијата за разредениот примерок 1:100 е помалку изразена. (лентите не се прикажани на Слика 5), а соодветните врвни струи на DPV и CV беа слични на оние што се очекуваа за NTC. Резултатите за фрагментот \(117\,\hbox {bp}\) се прикажани во Дополнителни информации. Негативните контролата предизвикала електрохемиски одговор од сензорот за PCB поради адсорпцијата на слободниот MB на електродата и интеракцијата на MB со едноверижниот прајмер олигонуклеотид. Затоа, секој пат кога се тестира примерокот, мора да се изврши негативна контрола и врвната струја на примерокот за тестирање во споредба со максималната струја добиена со негативната контрола за да се постигне диференцијално (релативно) мерење39,40 за да се класифицира тестот како позитивен или негативен.
(а) DPV и (б) врвна струја на CV за електрохемиско откривање на \(503\,\hbox {bp}\) фрагменти во примероци од езерска вода. Тестните примероци беа измерени во три примероци и споредени со контроли без шаблон (NTC) и позитивни контроли (PC).
Нашите наоди илустрираат различни механизми кои влијаат на перформансите на електрохемиските сензори за ампликони со различна должина за различни ДНК, со концентрации потврдени со оптички мерења со помош на спектрофотометар UV/Vis. Нашите набљудувања го нагласуваат увидот дека подолгите ДНК фрагменти до \(\приближно\) \(500\,\hbox {bp}\) може да се открие со поголема чувствителност и дека присуството на сол во примерокот не ја намалува чувствителноста Концентрацијата на ДНК што влијае на поголема чувствителност (ретко \({\hbox {ng}/{\upmu \hbox {l}}}\) и погоре).Покрај тоа, го истражувавме ефектот на различни типови примероци, вклучувајќи ампликони прочистени со гел со и без додадена сол, како и додавање на примероци од езерска вода во мерењата на DPV и CV.Забележавме дека DPV обезбедува подобра резолуција, бидејќи позадинската капацитивна струја исто така влијае на мерењето на CV, што го прави помалку чувствителен.
Засилувањето на подолгите фрагменти зависи од интегритетот на вирусната геномска РНК. Неколку студии покажаа дека засилувањето на подолгите фрагменти не е секогаш ефикасно поради деградацијата на РНК во околината и потенцијалот за спојување за време на изолацијата11,41,42,43,44 Забележавме дека методот на концентрација на вирусот базиран на PEG беше поефективен во концентрирањето на фагот Phi-6 шилест во примероците на езерската вода отколку методот на концентрација на вирусот базиран на алуминиум хидроксид. Способноста за откривање долги фрагменти на ДНК се покажа дека ја надминува потребата за мултиплекс ПЦР за засилување на повеќекратни шаблони со пократка должина и намалување на можноста за вкрстена специфичност.
Биолошките примероци се ретки, така што постои потреба да се дизајнира биосензор кој бара минимални примероци за тестирање. Електродите ENIG PCB што се користат во оваа студија бараат само \({5}\,{{\upmu \hbox {l}}}\ ) примероци за тестирање за покривање на ефективната површина на електродите. Дополнително, истата електрода може повторно да се употреби по чистењето пред да се даде следниот примерок. Засилените примероци не бараат додавање на други хемикалии освен метиленско сино, што е евтино и најчесто користената хемикалија. Бидејќи секоја електрода чини околу 0,55 долари (или 40 INR) за производство, овој биосензор може да биде исплатлива алтернатива на постоечките технологии за откривање. Табела 2 покажува споредба на оваа работа со други сензори пријавени во литературата долго време ДНК фрагменти во хетерогени примероци.
Имајќи предвид дека протоколите за електрохемиска детекција базирани на MB се потпираат на специфичноста на PCR, главното ограничување на овој метод е потенцијалот за неспецифично засилување во хетерогени примероци како што се отпадните води и езерската вода или користењето прајмери со ниска чистота. За да се подобри чувствителноста на методи за електрохемиска детекција за детекција на ДНК на непрочистени PCR производи користејќи немодифицирани ENIG PCB електроди, неопходно е подобро да се разберат грешките воведени од неискористените dNTP и прајмери и да се оптимизираат условите за реакција и протоколите за анализа. Дополнителни физичко-хемиски параметри како pH, температура и биолошки Потребата за кислород (BOD) од примерокот на вода, исто така, можеби ќе треба да се измери со цел да се подобри точноста на мерењето.
Како заклучок, предлагаме евтин електрохемиски ENIG PCB сензор за откривање вируси во примероци од животната средина (езерска вода). електроди со подолг рок на траење и без специфични барања за складирање и затоа се погодни за развој на мерни решенија со автоматска обработка на примероци распоредени во LMICs. вообичаено во примероците од животната средина ја намалува специфичноста на овој метод на сензори поради неспецифичното врзување на MBs со едно- и двоверижни олигонуклеотиди. Затоа, специфичноста на овој тест зависи од оптимизацијата на прајмерите и условите за реакција на PCR. Покрај тоа, CV и врвните струи на DPV добиени од тестираните примероци треба да се толкуваат во однос на одговорите добиени од негативната контрола (NTC) за секој тест. Дизајните и методите на електрохемискиот сензор претставени во оваа работа може да се интегрираат со автосемплери за да се развие целосно автоматизирана и ниска -Решение за трошоци што може да собира и анализира примероци и безжично да ги пренесе резултатите назад во лабораторија.
Cashdollar, J. & Wymer, L. Методи за почетна концентрација на вируси од примероци од вода: преглед и мета-анализа на неодамнешните студии.Ј.Примена.микроорганизам.115, стр. 1-11 (2013).
Gall, AM, Mariñas, BJ, Lu, Y. & Shisler, JL Водени вируси: бариери за безбедна вода за пиење. PLoS Pathogens.11, E1004867 (2015).
Shrestha, S. и сор.
Палечек, Е. & Бартосик, М. Електрохемија на нуклеинска киселина. Хемиски.Рев.112, 3427-3481 (2012).
Tani, A., Thomson, AJ & Butt, JN.
Wong, EL, Erohkin, P. & Gooding, JJ Comparison of Cation and Anion Intercalators for Electrochemical Transduction of DNA Hybridization by Long Range Electron Transfer.Electrochemistry.comminicate.6, 648-654 (2004).
Wong, EL & Gooding, JJ Пренос на полнење преку ДНК: селективен електрохемиски ДНК биосензор.anus.Chemical.78, 2138-2144 (2006).
Fang, TH et al. Microfluidic уред со PCR во реално време со истовремена електрохемиска детекција. биолошки сензор. Bioelectronics.24, 2131-2136 (2009).
Win, BY et al. Студија на механизмот за сигнализација и верификација на перформансите на електрохемиски PCR систем во реално време заснован на интеракцијата на метиленско сино со ДНК. Аналитичар 136, 1573-1579 (2011).
Ramirez-Chavarria, RG et al. Електрохемиски сензор базиран на изотермално засилување со посредство на јамка за откривање на sars-cov-2 во примероци од отпадна вода. Ј.Environment.Chemical.Britain.10, 107488 (2022).
Kumar, M. et al. Електрохемиско сензорирање на ампликоните SARS-CoV-2 со електроди од PCB. Сензорот е активиран. B Chemistry.343, 130169 (2021).
Kitamura, K., Sadamasu, K., Muramatsu, M. & Yoshida, H. Ефикасно откривање на РНК на SARS-CoV-2 во цврстата фракција на отпадни води.наука.општа средина.763, 144587 (2021).
Alygizakis, N. et al.Analytic Methods for SARS-CoV-2 Detection in Wastewater: Protocol and Future Perspectives.TraC trending anal.Chemical.134, 116125 (2020).
Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T. & Kashtan, N. Преживување на обвиениот бактериофаг Phi6 (сурогат за SARS-CoV-2) во испаруваните капки од плунка депонирани на стаклени површини.наука.Реп.10, 1-10 (2020).
Деј, Р., Длускаја, Е. и Ешболт, Њу Џерси.Водно здравје 20, 83 (2021).
Mindich, L. Прецизно пакување на три геномски фрагменти од двоверижен RNA бактериофаг\(\varphi\)6.microorganism.Moore.biology.Rev.63, 149-160 (1999).
Pirttimaa, MJ & Bamford, Секундарна структура на DH RNA фагот\(\varphi\)6 регионот на пакување.RNA 6, 880-889 (2000).
Bonilla, N. et al. Phages on the Tap – Брз и ефикасен протокол за подготовка на лабораториски залихи на бактериофаги. PeerJ 4, e2261 (2016).
Време на објавување: мај-27-2022 година